葡聚糖凝胶色谱结合高速逆流色谱提取蓝莓中花青素

  郭丹妮，向灿辉*，陈阳*，王文君，吴钰彬

  遵义医学院珠海校区生物工程系（珠海519041）

摘要试验结合葡聚糖凝胶色谱及高速逆流色谱对野生蓝莓中的花青素进行了分离纯化。蓝莓粗提物先经过葡聚糖凝胶色谱初步分离，得到花青素含量高的组份，再经高速逆流色谱分离，以MTBE-正丁醇-乙腈-水(体积比1:3：1：5)为两相溶剂体系，流速0.5 m L/min、主机转速1 860 r/min以及检测波长280 nm的条件下进行分离，从蓝莓的葡聚糖凝胶色谱柱分离产物中一次性分离得到两种花青素，经超高效液相色谱分析，2种化合物的纯度分别为65.0%和90.0%。

关键词蓝莓；花青素；高速逆流色谱；超高效液相色谱

 蓝莓( Blueberry)又名越桔，是杜鹃花科( Ericaceae)越桔属（Vaccinium Spp．）的小果浆

果树。已有的研究表明蓝莓中含有的花青素是众多含花青素植物中性能优良的品种之一。花青素( Anthocyanin)属于黄酮类水溶性色素，作为一种天然着色剂，在食品、化妆品等领域得到了广泛应用，特别是花青素具有很强的抗氧化能力，能有效清除人体代谢过程中产生的自由基，起到延缓衰老、保护血管、降低心血管疾病发病率、提高人体免疫力及起到防癌抗癌的作用。而蓝莓中富含花青素，要对蓝莓进行相关活性研究及深加工，功能成分的分离提纯是关键技术。因此，建立蓝莓中活性成分的有效分离纯化具有非常重要的意义。

 高速逆流色谱是一种基于液一液分配的色谱技术，因为不使用固态填料，容易实现较大的进样量和制备量，同时也可以避免固态填料对样品的不可逆吸附、污染和失活等。而且由于不使用固体填料，制备成本也因此相对降低，故近年来得到了广泛的应用。试验将结合高速逆流色谱技术和葡聚糖凝胶色谱，对蓝莓中花青素进行分离提纯，建立一种快捷、简单的分离方法，为花青素的分离纯化提供参考。

1试验部分

1.1仪器与设备

 TBE-20A高速逆流色谱仪：上海同田生物技术股份有限公司；Waters AcquityUPLC M-Class超高效液相色谱仪：沃特世科技（上海）有限公司；IKA V-C旋转蒸发仪基本型：艾卡（广州）仪器设备有限公司；低温冷却循环泵：上海豫康科教仪器设备有限公司；ALPHA 2-4 LSC冷冻干燥机：德国Marin Christ公司；数显电热鼓风干燥箱：上海浦东荣科学仪器有限公司。

1.2试剂与材料

 蓝莓干果：市售；粗提物的制备及HSCCC分离用正丁醇、乙腈、甲基叔丁基醚( MTBE)：分析纯；超高效液相色谱用甲醇：色谱纯，美国天地公司；过滤蒸馏水。

1.3蓝莓粗提物的制备

  蓝莓干果500 g，20倍量经1%盐酸酸化的体积分数为60%乙醇分3次，水浴50℃浸泡，每次2h，合并提取液，减压浓缩并冷冻干燥得到浸膏40.1 g，供葡聚糖凝胶柱色谱分离使用。

1.4葡聚糖凝胶色谱分离

 取蓝莓粗提物浸膏10.0 g，10010甲醇水溶液溶解，0.45 μm滤膜过滤，上柱用梯度甲醇-水溶液洗脱，收集洗脱液，薄层色谱法检视，收集目标样品，浓缩后冷冻得6.0 g样品，供高速逆流色谱法分离用。

1.5分配系数(K)的测定

 分别量取平衡后的溶剂体系上相、下相各2.00 m L于同一试管中，加入葡聚糖凝胶色谱柱分离产物，充分振摇静置分层，分别取0.20 m L上、下相溶液用UPLC进行检测。以上相组分峰面积（A上）与下相组分峰面积（A下）的比值计算样品在溶剂体系中的分配系数K，计算公式：K= A上/A下。

1.6  HSCCC法分离制备过程

 将经超声脱气的两相溶剂体系中固定相（上相）以5 m L/min的速度泵入高速逆流色谱仪的螺旋分离管中，待上相充满整个螺旋管后，打开主机，调节按钮，使高速逆流色谱仪螺旋管柱按顺时针的方向旋转，当转速达到1 860 r/min时，将流动相（下相）泵人高速逆流色谱仪，流速为0.5 m L/min，待下相流出时，平衡完毕，计算保留率（保留率=（28-V）／20×100%，其中V=V总-V下相）。葡聚糖凝胶柱分离样品用流动相（下相）溶解后进样，检测波长280 nm，根据出峰信号及薄层色谱检视结果收集流出液，流出液冷冻干燥后进行UPLC分析。

1.7  UPLC分析条件

 色谱柱：反相C18柱(2.1 mm×50 mm，T3 1.8m)；流动相A：0.1%三氟乙酸水溶液；流动相B：乙腈；梯度洗脱程序：0～6.12 min，10%～60%B；6.12～8min，60%～l0%B；流速：0.61 m L/min；检测波长：280 nm；柱温：室温；进样量：0.2 m L。

1.8对目标分离产物的分析

 高速逆流色谱分离得到的样品经UPLC、薄层及显色反应进行定量、定性分析。

2结果与讨论

2.1  选择HSCCC分离条件

 高速逆流色谱中选择合适的溶剂系统是成功分离样品的重要条件，溶剂系统的选择可以通过测定分配系数K来确定，K值的合适值为0.5～2.0之间，此外，还需满足溶剂体系分层时间短(一般要求不超过30s)，保留率>30%。试验比较了4个溶剂体系的K值(n=5)，结果见表1。结果表明，在体系1中，2种花青素的K值均为2.2，超出了理想K值范围，过大的K值会导致出峰时间长，分离效率低。在溶剂体系2～4中，2种花青素的K值分别均在0.5～2之间。但溶剂体系2的固定相保留率为26%，小于正常固定相保留率( >30%)，过低的固定相保留率会导致固定相的流失，不利于样品的分离，达不到理想的分离效果。而溶剂体系3、4的固体保留率分别为50%和70%，均大于30%，最后经上机分离样品的结果表明溶剂体系3分离效果不理想。而采用溶剂体系4对样品进行分离，经UPLC及薄层色谱检视，分离效果良好，故试验采用溶剂体系4作为高速逆流色谱的分离溶剂体系。

2.2  HSCCC分离结果

 以MTBE-正丁醇-乙腈-水（体积比1：3：1:5）为两相溶剂体系，按照试验部分1.6所述方法对葡聚糖凝胶色谱柱分离产物进行分离纯化。取葡聚糖凝胶色谱柱分离产物置于试管内，加入下相振摇溶解后经HSCCC进行分离，HSCCC结果见图1。流出液经薄层色谱(聚酰胺板，展开剂：正丁醇-醋酸-水(体积比8:2：1》及UPLC检测，图1中峰1和峰2部分为纯度较高的组分，减压浓缩、冷冻干燥后得5 mg样品1和6mg样品2。

2.3  UPLC分析结果

 采用乙腈-0.1%三氟乙酸水溶液作为流动相，取野生蓝莓葡聚糖凝胶色谱粗提物、样品1和样品2用甲醇（色谱级）溶解并过0.45 μm滤膜后，经UPLC分析，结果见图2。图2A表明目标成分可以得到良好的分离，图2B和2C表明经过一次HSCCC分离之后，得到了纯度较高的样品1和样品2。利用面积归一法（A=A物质的峰面积／所有出峰物质的总峰面积×100%），计算得化合物1和2的纯度分别为65.0%和90.0%。

2.4  目标分离产物的定性鉴别结果

 用1%盐酸乙醇溶解样品1和样品2后分别观察其溶液颜色，发现均为红色，调节pH至碱性显蓝色，此颜色变化符合花青素的化学性质。  将化合物1和化合物2按照方法1.7节UPLC分析条件进行分析，发现两者的光谱图中276.7 nm处均有较强吸收，而花青素分子中存在高度分子共轭体系，在280 nm附近有较强吸收，由此可推断样品l和样品2可能是花青素。

3结论

  试验采用MTBE-正丁醇-乙腈-水(体积比1:3：1：5)为两相溶剂体系，经高速逆流色谱从蓝莓中一次性分离得到了两个纯度较高的花青素样品，纯度分别为65.0%和90.0%。具有快捷、简便等特点。应用高速逆流色谱法从蓝莓中分离提取花青素的文献报道甚少，该研究为蓝莓中花青素的分离制备提供了一种实用、新型的方法，并为HSCCC分离高极性化合物提供了思路。