邱立红，靳彦文，方毅，付洋波，白圆圆，颜芳，朱贵明，曹诚
1．佳木斯大学基础医学院，黑龙江佳木斯154007;
2．军事医学科学院生物工程研究所，北京100850
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[摘要]目的：构建酵母单杂交文库，筛选出与钠碘同向转运体上游增强子(NLE)特异性结合的蛋白质分子，进一步研究其与NUE相互作用的分子机制。方法：应用酵母单杂交系统，以NUF,为酵母单杂交的“诱饵”，对甲状腺癌Kl细胞的。DNA文库进行初步筛选，采用DNA测序技术及生物信息学技术对筛选的克隆进行进一步功能分析。结果：对文库中的阳性克隆测序，获得53条可读序列，Blast X比对分析及基因功能注释发现其中11条具有DNA结合功能，包括RhoGrrp酶激活蛋白35(ARHGAP35)、锌指蛋白394(ZNF394)、上游刺激因子2(USF2) .SOX9等结论：应用酵母单杂交技术初步筛选出与甲状腺癌Kl细胞NUE相互作用的候选蛋白，并对这些蛋白质进行了初步的功能分析。
[关键词]钠碘同向转运体上游增强子；酵母单杂交；cDlA文库
甲状腺滤泡细胞一个主要的功能是能利用碘合成甲状腺激素。在这一过程中，碘通过位于细胞基底膜上的钠碘同向转运体(sodium iodide symport-er，NIS)转运到滤泡细胞中，这是甲状腺激素合成的第一步。甲状腺具有强大的浓聚碘的能力，这一特点是利用放射性碘进行甲状腺疾病显像诊断和甲状腺疾病治疗的基础。甲状腺癌是内分泌系统常见的恶性肿瘤之一，它的发病率正逐年上升。有研究表明，与正常甲状腺组织相比，甲状腺癌组织对碘的摄取显著减少，并且NIS在转录水平和翻译水平也有明显减少，导致癌组织不能聚集足够的放射碘，从而给治疗带来一定的困难。肿瘤中NIS活性减少与预后不良有关，确定与NIS活性相关的因子对提高放射性碘治疗至关重要。
在甲状腺中，促甲状腺激素(TSH)是调节NIS表达的主要作用因子，促甲状腺激素受体(TSHR)通过Gs蛋白激活腺苷酸环化酶，使环腺苷酸(cAMP)在甲状腺细胞中积累，而cAMP能刺激NIS的顺式作用元件相关的一些信号通路，促进NIS转录，其中钠碘同向转运体上游增强子(soclium iodide symport-er upstream enhancer，NUE)是对TSH应答最明显的顺式作用元件。NUF位于人类19号染色体NIS基因编码区上游9242～9300处，包括一个配对盒基因8(paired box gene 8，PAX8)结合位点和一个cAMP应答元件结合蛋白(CREB)位点，这2个位点是NUE发挥全部活性所必需的。CREB是一个碱性亮氨酸拉链(B-ZIP)转录因子，包含一个亮氨酸拉链结构域，该结构域能调节DNA的结合，并能与其他B-ZIP蛋白形成同源或异源二聚体，而其他的蛋白或转录因子或许参与NUE的激活。PAX8是甲状腺发育和分化的一个关键转录因子，甲状腺特异表达基因NIS的转录依赖于PAX8的活性。PAX8结合到NUE上来应答TSH刺激是激活NUE的主要过程。NUE是NIS的重要调节元件，它的表达能直接对NIS的表达产生影响。因此，了解其作用机制，对从分子水平上解释NIS在甲状腺癌中表达减少有重要意义。
酵母单杂交系统是近年发展起来的研究DNA与蛋白质相互作用的有效方法之一，其原理是根据在细胞内DNA结合蛋白与DNA顺式作用元件结合调控报告基因的表达，从而确定与DNA相互作用的蛋白质。在此，我们采用酵母单杂交系统，以NUE为诱饵，从甲状腺癌Kl细胞的cDNA表达文库中筛选与NUE特异性结合的蛋白质，以期为NUE与甲状腺癌的分子机制研究提供线索。
1 材料与方法
1.1材料
乳头状甲状腺癌K1细胞为本实验室保存；大肠杆菌DH5a感受态菌株、DNA marker、大肠杆菌质粒小提试剂盒购白天根生物科技有限公司；T。DNA连接酶及限制性内切酶购白NEB公司；凝胶回收DNA试剂盒购自QIAGFN公司；PCR试剂盒购自TaKa-Ra；酵母单杂交试剂盒，酵母质粒提取试剂盒(EasyYeast Plasmid isolation Kit),YPDA、SD/- Ura及SD/-Leu培养基及AbA抗生素均购自Clontech公司；PCR引物由北京奥科鼎盛生物生物科技有限公司合成；LB培养基、氨苄西林(Amp)、PBS等相关溶液的配制及操作按照《分子克隆实验指南》进行。
1.2酵母单杂交诱饵质粒载体pAbAi-NUE的构建
合成含HindⅢ、XhoI粘性末端的NUE序列（正向序列为5，-AGCTTCAGTTCCACGTGAGTGCCCTG GGGGACTCCCCTGGAGGGAAGTGCCTGCTCTGAC GCACJGAGC-3-，反向序列为5，-TCGAGCTCCTGCG TCAGAGCAGGCACTTCCCTCCAGGGGAGTCCCCCA GGGCACTCACGTGGAACTGA-3 7，将2条单链退火合成双链NUE），用限制性内切酶HindⅢ、Xho I双酶切pAbAi载体，与双链NUE序列连接为重组载体pAbAi-NUE，PCR鉴定该重组载体（PCR鉴定正向引物为5，-AGGTTTTGTTCTGTGCAGTTGG-3'，反向引物为5'- CTTGTTTCTAAATCCGCrrACATGGC_ 3，,产物为478 bp。反应条件：940C预变性3 min;980C 10 s，55℃30 s，680C1 min，30个循环；68℃7 min)，经1%琼脂糖凝胶电泳验证，阳性质粒送奥科鼎盛生物科技有限公司测序。
1.3报告酵母的制备
pAbAi- NUE经BstB I单酶切线性化后转入YIHGold酵母中，用SD/-Ura选择培养基于30。C培养3—5 d，形成诱饵菌株YIHGoldl Bait-pAbAi]，挑取大的单菌落于PCR管中，用Clontech试剂盒Match-maker Insert Check PCR Mixl做菌液PCR鉴定，l%琼脂糖凝胶电泳检测，以p53-AbAi为阳性对照。
1.4酵母自激活验证
挑YIHGold[ Bait-pAbAi]的单克隆悬浮于0.9c/cNaCl溶液中，并分别涂板在SD/- Ura、SD/-Ura+AbA(100 ng/mL)、SD/-Ura+AbA( 200 ng/ml_,)、SD/-Ura+AbA(300 ng/mL)、SD/-Ura+AbA( 400 ng/mL)、SD/-Ura+AbA(500 ng/mL)培养基中，30。C培养3—5（1，以筛选诱饵菌株的自激活活性。
1.5文库构建
用QIAGEN公司的RNeasy Mini Kit提取乳头状甲状腺癌Kl细胞总RNA;取1ug总RNA为模板，以Oligo( dT)为引物反转录合成cDNA第一链，Long distance PCR反应合成双链SMART clscDNA[具体步骤参照Clontech公司的Matchmaker GoldYeast One-Hybrid Library Screening System产品说明书），用1%琼脂糖凝胶电泳检测cDNA文库质量。
1.6文库转化
用SMART dscDNA 20 yL、pGADT7-Rec ADCloning Vector 6poL、PEG/LiAc溶液2.5 mL、变性的Yeastmaker Carrier DNA 20 p*L共转化诱饵酵母感受态600uL，转化液分别稀释至1/10、1/100和1／1000，并涂布在亮氨酸缺陷的SD/- Leu选择培养基上，统计筛选的总克隆数以计算文库滴度（总克隆数=cfu/涂板体积×稀释率×细胞悬液总体积）。将剩余悬液涂布于添加AbA抗生素的SD/- Leu培养基上，其中AbA的浓度参照酵母自激活所筛选出的浓度，30。C培养3—5 d。
1.7酵母单杂交的初步筛选
挑选阳性克隆较大者转涂于新的选择平板，进行单菌落纯化，300C培养3—5 ci后挑取大的纯化的单菌落于PCR管中，用Clontech试剂盒MatchmakerInsert Check PCR Mix2做菌液PCR鉴定，1%琼脂糖凝胶电泳检测。
1.8 阳性克隆的复筛
将Colony PCR鉴定为阳性的克隆送北京奥科鼎盛生物科技有限公司测序，测序引物分别为5T7(5'- TAATACGACTCACTATAGGGCGA- 3')和3AD（5，-ACATGGTGCACGATGCACAG-3'），将测序结果在NCBI( http://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi)网站进行Blast序列比对，初步分析cDNA插入序列。为避免假阳性，对得到的阳性克隆再次进行鉴定，即从这些阳性克隆中抽提酵母质粒，转人大肠杆菌DH5ce中扩增，从中抽提质粒DNA，将它们重新转化YIHGold及YIHGolcl[ Bait-pAbAi]酵母感受态细胞，涂布在SD/-Leu+AbA(500 ng/mL)培养基上，30。C培养3—5 d，然后对阳性克隆进行功能注释分析。
2结果
2.1 诱饵载体的构建及抗性筛选结果
对pAbAi-NUE进行PCR鉴定，PCR产物长度为478 bp（图1A）；对阳性质粒进行测序，结果表明NUE序列（5'- CAGTTCCACGTGAGTGCCCTGGGG GACTCCCCTGGAGGGAAGTGCCTGCTCTGACGCAGGAG-3'）已连接到pAbAi载体上，诱饵载体pAbAi-NUE构建成功（图1B）。
2.2重组酵母的筛选
将诱饵载体pAbAi-NUE经BstB I单酶切后转化酵母菌株YIHGold感受态细胞，并在SD/- Ura培养基上培养，30cc培养3～5 d后长出阳性克隆，表明诱饵载体质粒已转入酵母。用Clontech公司的MatChmaker Insert Check PCR Mixl试剂盒对诱饵菌株YIHGold[Bait-pAbAi]做Colony PCR鉴定，结果表明重组酵母YIHGold l Bait-pAbAi]构建成功（图2）。
2.3 酵母自激活验证
将YIHGold[ Bait-pAbAi]单克隆分别涂布在1.4所述培养基上，对酵母进行白激活活性筛选。结果表明，当AbA浓度为400 ng/mL时几乎无任何酵母菌斑产生，说明几乎无酵母内源蛋白与NUE结合（图3）。为确保出现的假阳性率最低，选择500 ng/mL作为文库筛选时的AbA浓度。
2.4 cDNA文库的构建与质量鉴定
采用RNeasy Mini Kit试剂盒提取Kl细胞的总RNA，由1%琼脂糖凝胶电泳检测结果可知，总RNA的28S、18S和SS rRNA条带清晰，且28S亮度约为18S的2倍（图4A），说明总RNA质量较好，没有发生降解和污染，可用于构建cDNA文库。而cDNA文库的弥散范围为300—1500 bp，在该弥散范围内筛选到的插入片段较长（图4B），说明所构建的cDNA文库合格。
2.5 酵母单杂交的初筛结果
将SMART dscDNA和线性化的pGADT7- RecAD cloning vector共转化YIHGold[ Bait-pAbAi]感受态细胞，并涂布于SD/-Leu+AbA(500 ng/mL)培养基上进行cDNA文库的初步筛选。将共转化液稀释至1/100时，可长出216个单克隆，通过计算可知文库滴度为3.2sxi06大于1.oxi06，表明cDNA文库的滴度符合要求，酵母单杂交文库构建成功。此外，经过重新涂板长出的单克隆再经Colony PCR鉴定(图5)，得到的阳性克隆用于进一步筛选。
2.6 阳性克隆的测序及分析
选取300个Colony PCR鉴定为阳性的克隆送奥科鼎盛生物公司测序，对测序结果进行分析，去除低质量及冗余序列并与GenBank数据库进行Blast比对后，共获得53条可读序列。为进一步验证阳性克隆的可靠性，我们对阳性克隆提取酵母质粒，将酵母质粒转化大肠杆菌DH5a并提取扩增的质粒重新转化YIHGold及YIHGolcl[ Bait-pAbAi]感受态细胞，分别涂布在SD/-Leu+AbA(500 ng/mL)培养基上培养，结果发现转化YIHGold[ Bait-pAbAi]感受态细胞的质粒能在该培养基上正常生长，而转化YIHGold感受态细胞的质粒不能在该培养基E生长。对这些阳性克隆序列用NCBI( http://www.ncbi.nlm.nih.gov/)、UniProt( http://www.uniprot.org/)和DAVID( https://da-vid．ncifcrf.gov/)等数据库相关程序与软件进行功能注释，发现1 1个具有DNA结合功能的蛋白质(图6)，包括Rho GTP酶激活蛋白35(Rho GTPase acti-vatlng protein 35，ARHGAP35)、锌指蛋白394( Zincfinger protein 394，ZNF394)、上游刺激因子2(up-stream stimulator factor 2,USF2)，SOX9 (SRY- re-lated high mobility group-box gene 9)等。
其中SOX9是一个转录因子，在各种生理及病理学过程中均有重要作用。SOX9基因表达上调能增加Akt的磷酸化水平”oI，而Akt的磷酸化能激活PI3K-AKT相关信号通路，促进甲状腺癌的发生与发展。此外，PI3K的抑制剂能刺激甲状腺细胞中钠碘同向转运体的表达及碘的摄取。
USF2为碱性一螺旋一环一螺旋一亮氨酸拉链(ba-sic- helix-loop- helix-leucinezipper. b- HLH- LZ)转录因子家族成员r”、，有一个DNA结合区、一个螺旋一环一螺旋( HLH)模体和一个亮氨酸拉链结构(Zip)，它的最主要的生理功能是作为转录因子，与启动子中含有E-box序列(CANNTG)的靶基因结合，从而调节靶基因的表达。
因此，我们认为SOX9基因可能与NUE结合，抑制NUE的增强作用，进而对NIS mRNA的表达起抑制作用；而USF2蛋白的B-Zip结构域可能与NUE结构中CREB的B-Zip结构域形成同源或异源二聚体，参与NUE的激活，从而提高NIS的表达，进一步提高放射碘治疗的有效性。但这种可能的作用方式，需要后续实验来进一步证实。
3讨论
甲状腺癌是最常见的内分泌肿瘤，由于甲状腺滤泡细胞可以利用碘合成甲状腺激素，放射碘131成为治疗分化型甲状腺癌的主要手段。放射碘对甲状腺癌的治疗依赖于甲状腺的摄碘能力，它能通过质膜上的钠碘同向转运体转运到癌细胞并发挥局部破坏作用。然而一些研究表明，与正常甲状腺组织相比，甲状腺癌组织中NIS的mRNA和蛋白表达减少，使有些癌症患者丧失了摄碘能力，从而不能应用这种物理疗法进行治疗。如果能阐明NIS基因表达的分子机制，可能会提高NIS在甲状腺癌中的表达量，从而显著改善这种治疗无效的状况。
在甲状腺中，TSH是NIS基因表达的主要刺激物，内源或外源的TSH能增加NIS的表达来提高放射碘治疗的有效性。TSH通过cAMP信号通路调节NIS mRNA和蛋白的表达。TSH在转录和转录后水平均能上调NIS的表达，TSH通过刺激NIS上游增强子，增加NIS蛋白的半衰期，并刺激NIS转运到质膜上。
转录因子是调控真核生物基因表达的重要因子，典型的转录因子都有DNA结合区，不同的转录因子与靶基因启动子的顺式作用元件特异性结合并相互作用，从而激活或抑制靶基因的表达。在研究DNA-蛋白质之间相互作用的技术中，酵母单杂交技术是一种体内鉴定DNA与蛋白质相互作用的有效方法，它能直接从基因文库中找到编码蛋白质的DNA序列。此外，用该系统筛选到的蛋白质是在体内相对自然条件下有结合功能的蛋白质，比其他体外技术获得的结果更能体现真核内基因表达调控的真实情况。当然，酵母单杂交作为一种研究蛋白
质与DNA相互作用的初步实验技术手段，其结果还需要进一步验证。
我们以NUE为诱饵，从甲状腺癌Kl细胞cDNA融合表达文库中钓取Kl细胞中能与NUE结合的转录因子。结果表明诱饵载体pAbAi-NUE和cDNA融合表达载体pGADT7-Rec AD Cloning Vector共同转化酵母细胞的效率为3.25Xl06，达到了酵母单杂交所需要的文库滴度，并日．在SD/- Leu+AbA( 500ng/mL)培养基上也筛选到大量克隆。对其中的300个阳性克隆进行测序，获得53条可读序列。鉴于酵母单杂交文库假阳性高的缺点，我们将选择的阳性
克隆在SD/-Leu+AbA( 500 ng/mL)培养基划线后提取酵母质粒，并转化大肠杆菌DH5a扩增后提取质粒，再重新转化YIHGolcl[Bait-pAbAi]及YIHGold酵母感受态细胞，培养在SD/-Leu+AbA(500 ng/mL)培养基中，结果发现转化YIHGold lBait-pAbAi]的质粒在该培养基中能正常生长，而转化YIHGold的质粒则不能长出克隆。对上述53条序列进行功能注释分析，发现它们编码的蛋白质中有1 1个具有DNA结合功能，包括Rho GTP酶激活蛋白35、锌指
蛋白394、上游刺激因子2等。
综上，我们构建了Kl细胞特异性表达顺式元件结合蛋白酵母单杂交文库，为克隆和分离Kl细胞中特异表达的转录因子提供了候选基因，为分析这些候选基因与NUE的作用机制，以及对NIS表达的调节进行深入研究奠定了基础。
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