过表达SGK3肝癌细胞BEL-7402在去甾体激素血清中的抗凋亡研究

吕文杰，王洪涛，黄芳，王健，王芃，洪鎏，周建光，潘耀振，李山虎

1．贵州医科大学，贵州贵阳550001；2．军事医学科学院生物工程研究所，北京100850

——《生物技术通讯》

[摘要]目的：构建过表达血清与糖皮质激素调节激酶3 (SCJK3)的质粒以及稳定表达SCK3的肝癌细胞系BEI。一7402，研究其在去甾体激素胎牛血清(FBS)中的抗凋亡能力。方法：PCR扩增SCK3基因，将扩增产物连接到pCDH载体，构建出pCDH-SCJK3的慢病毒载体质粒，将其同空白对照pCDH-NC分别与慢病毒包装载体共转入29 3'l'细胞，包装成慢病毒pCHD-SGK3和pCDH-NC；将构建的慢病毒感染肝癌细胞BEL-7402并用嘌呤霉素筛选，Western印迹检测SGK3的表达；观察细胞在FBS及去甾体激素FBS中的生长情况。结果：包装出pCDH-SGK3重组慢病毒，此慢病毒感染肝癌细胞系BEL-7402后获得表达；CCK8实验表明过表达SCK3可促进肝癌细胞的生长，BEL-7042细胞中有雄激素的表达，去甾体激素FBS中细胞生长受到抑制，过表达SGK3可增强肝癌细胞在去甾体激素血清中的抗凋亡能力。结论：在肝癌细胞BEL-7402中过表达SGK3可促进细胞生长，可增强细胞在去甾体激素FBS中的抗凋亡能力。

[关键词]血清与糖皮质激素调节激酶3；肝癌；BEL-7402细胞；去甾体激素胎牛血清

 原发性肝癌包括肝细胞癌、肝母细胞瘤、肝血管肉瘤和胆管上皮癌，其中肝细胞癌占80%，一直以来是第三大癌病死因，也是世界第六大癌病。已有学者报道肝癌细胞的发病率有明显的性别差异，并且有研究证明雄激素受体(androgen receptor，AR)在其中起着重要作用。有学者指出雄激素受体在肝癌患者中表达，并且AR(+)组癌症复发率较AR（一）组高，患者预后前者也较后者差，肝癌患者中较高的血清睾酮水平预示着更高的5年肿瘤再发率和糟糕的长期预后l61。血清与糖皮质激素调节激酶3(serum and glucorticoid regulated kinase 3,SGK3)是近年来逐渐受到重视的激酶分子，研究表明其在乳腺癌细胞、前列腺癌细胞、肝癌细胞等的生长调控中扮演重要角色。SGK3是AGC家族的丝氨酸／苏氨酸激酶，通过PI3K途径被激活。SGK家族与AKT家族拥有相似的结构域，并且其激酶区域拥有相似的识别性，这使得SGK与AKT在体外能识别相同模体，在体内有相同的底物。SGK在细胞中参

与生长、增殖、存活和迁移等多种生理作用。本实验意在建立过表达SGK3的细胞系，并探究肝细胞在去甾体激素血清中的生长情况以及过表达SGK3的肝癌细胞在去甾体激素血清中的抗凋亡能力。

1 材料与方法

1.1材料

 BEL-7402细胞、C4-2细胞、pCDH载体均为本实验室保存；胎牛血清( FBS)、DMEM购于Gibco公司；T。DNA连接酶及其缓冲液，限制性内切酶BamH I、NotI、EcoR I购白TaKaRa公司；质粒提取试剂盒及Vigofect转染试剂购自Vigorous公司；胶回收试剂盒购白Axgen公司；CCK-8试剂盒购自DOJINDO公司；ULybre,ne购白Santa Cruz公司；嘌呤霉素、活性炭购白Sigma公司；Dextran T-70购自Solarbio公司；SGK3、v微管蛋白(^y-tubulin)抗体购自Cell Si-galling公司；山羊抗兔、兔抗山羊抗体购自中杉金桥公司；Western印迹发光液购自TIANGEN公司。

1.2去甾体激素FBS的制备

 使用前用去离子水清洗活性炭，配制含0.5%Dextran T-70和5%活性炭的FBS 45 mL，56。C水浴箱孵育30 min，间断混匀，然后置于旋转摇床4℃过夜，次日用0.22um滤膜过滤除菌，收集滤液即为去甾体激素的FBS(CSS)。

1.3  质粒的构建

 以实验室现有SGK3质粒为模板，在NCBI上查找SGK3 DNA序列，在其上、下游分别添加相应酶切位点与保护性碱基，构建序列SGK3-F（5'- CGGGATCCCAAAGAGATCACACCATG-3 7）和SGK3-R(5'-GAGCGGCCGCCAAAAATAAGTCTTCTGAAGG-3').PCR扩增体系：模板0.5 uL，SGK3-F、SGK3-R各1uL，dNTP1uL．Pfu酶缓冲液2uL，Pfu酶0.4uL，ddH：0 14.1 uL。扩增程序：预变性94。C3 min，变性95。C 30 s，600C 30 s，72。C 1.4 min，以无引物体系为空白对照，进行32个循环进行PCR扩增。1010琼脂糖凝胶电泳鉴定并用胶回收试剂盒回收PCR产物。用Barn,H I和NotI对扩增片段（28.5uL胶回收产物，BamH I、Not I各0.35ILL，缓冲液K 1.75UL，BSA 3.5 UL）和载体（1ug载体，BamH I、NotI各0.35 uL，缓冲液K 1uL，BSA 2uL，加ddH：0至20ILL）过夜酶切，酶切产物直接回收，与T。DNA连接酶过夜连接（酶切回收产物15 UL，T。DNA连接酶0.4 uL，T。DNA连接酶缓冲液2uL，ddH：02.6 uL)，将连接产物转化大肠杆菌DH5a，涂板培养，挑取菌落于37。C振荡培养，经菌液PCR鉴定，送公司测序，选择成功连接到载体的菌液样品提取质粒，即获得pCDH-SGK3质粒。

1.4慢病毒的包装

 用含10% FBS的DMEM培养液培养293T细胞，转染前1d传至10 cm培养皿中，待其密度长至70%～80%，更换新鲜培养液，用PEI转染试剂将质粒pSPA- 2G、pXA- X2及pCDH空载体(pCDH-NC)、pCDH-SGK3分别共转入293T细胞，次日更换为新鲜培养液，转染后24 h收集一次培养液，即为病毒毒液，更换新鲜培养液待48 h以后再次收集病毒毒液，将2次收集的毒液于1700 r/min离心3 min，吸取细胞沉淀，以0.45 um滤膜过滤后，置-80℃冰箱保存。

1.5过表达SGK3肝癌细胞株的构建

 用含10% FBS的DMED培养液在10 cm培养皿中培养BEL-7402细胞，感染前进行细胞传代，待细胞生长至40%可开始感染，感染前2h更换5 mL新鲜培养液，并加入10 mg/mL的ULybrene 10 uL，使其在感染时终浓度为10 ug/mL，然后各取5 mL病毒毒液，室温慢融，加入BEL-7402细胞培养液中，轻摇混匀感染细胞，感染后12 h更换新鲜培养液继续培养24—48 h，待细胞生长恢复，加入终浓度为lg/mL的嘌呤霉素进行筛选，筛选时问为48 h。将筛选细胞冻存或继续培养以待进一步实验。

1.6  Western印迹分析

 收集筛选后的细胞，用RIPA蛋白裂解液裂解，收集蛋白，加入5xSDS，沸水浴8 min后行10%聚丙烯酰胺凝胶电泳，将凝胶放入转膜仪使蛋白转至硝酸纤维膜，以5%脱脂奶粉室温封闭30 min，4℃孵育一抗过夜，或孵育更长时间，然后用TBST洗膜液洗膜3次，每次5 min，室温孵育二抗2～4 h，TBST洗膜3次，每次5 min，滴加化学发光液，暗室胶片显影。

1.7  CCK8检测细胞增殖

 将过表达和敲低SGK3的肝癌细胞及其分别的空白对照培养后以700／孔的密度接种至96孔板中，培养至第0、2、4、7d分别更换为含100 uL 10%CCK8的培养液，37C孵育2.5 h后检测D…。值，记录结果，校正后绘制CCK8生长曲线。

1.8激素去除的细胞系抗凋亡实验

 将FBS用葡聚糖和活性炭处理，制备去甾体激素血清，将细胞培养在60 cm培养皿中，待细胞生长至30%—40%，分别在培养皿中更换新鲜的含10%CSS的DMEM培养液以及含10% FBS的DMEM培养液，4d后收集细胞，Western印迹检测C-PARP。

2结果

2.1  pCDH-SGK3重组慢病毒载体的构建

以实验室保存的SGK3质粒为模板，PCR扩增SGK3编码序列，1%琼脂糖凝胶电泳鉴定获得约1500 bp的条带，与SGK3编码序列全长(1496 bp)一致（图1）。切取胶块用胶回收试剂盒回收，用BamH I和NotI对片段与载体pCDH进行双酶切，回收后将片段和载体用T4DNA连接酶连接，转化大肠杆菌DH5a，涂板培养后挑菌行PCR菌液鉴定，将阳性菌液送公司测序。经对比，插入片段序列与SGK3基因的编码序列完全一致。

2.2  BEL-7402-SGK3稳定细胞系的Western印迹

将构建的质粒pCDH-SGK3和空白质粒pCDH-NC分别与慢病毒包装载体共转入293T细胞，制作并收集慢病毒毒液，使用其感染BEL-7402细胞，经过药物筛选，获得稳定表达SGK3的BEL-7402肝癌细胞系。培养该肝癌细胞系，提取蛋白行SDS-PAGE，Western印迹检测表明SGK3在所构建细胞系中得到表达（图2）。

2.3过表达SGK3促进BEL-7402细胞的生长

研究表明，SGK3可以促进肝癌细胞生长，因此我们将构建的稳定过表达SGK3的细胞与其空白对照接种于96孔板，以第0、2、4、7d作为观察点，检测D，～值，校正后用GraphPad绘制生长曲线，经SPSS13.0软件做统计处理后的结果如图3，可发现过表达SGK3的BEL-7402肝癌细胞生长比空白对照增快。

2.4  BEL-7402细胞中雄激素受体的检测

提取BEL- 7402细胞的蛋白，SDS-PAGE后行Western印迹检测，同时以等量（上样量为50 p-,g）的C4-2细胞蛋白为对照，检测雄激素受体在BEL-7402细胞中的表达。结果如图4，用雄激素受体抗体能在相对分子质量约110Xl03处检测到特异条带，说明BEL-7402肝癌细胞中有雄激素受体的表达。

2.5  CCk-8检测BEL-7402细胞在去甾体激素FBS中的生长。

将正常BEL-7402肝癌细胞接种在96孔板中，用完全培养液以及含10% CSS的培养液分别培养，用CCK-8检测培养第0、2、4、7d的生长情况。用酶标仪检测D，，。。。值，校正后使用GraphPad绘制生长曲线。结果如图5，细胞在去激素血清中的生长速度较完全培养液培养的细胞减慢。

2.6过表达SGK3促进BEL-7402细胞在去甾体激素FBS中的抗凋亡能力

用完全培养液与含10% CSS的培养液培养过表达SGK3的肝癌细胞系及其空白对照，4d后收集培养液（包含上清死亡细胞）与细胞，离心后用RIPA裂解液裂解细胞沉淀，收取蛋白，进行SDS-PAGE和Western印迹检测，使用C-PARP抗体检测细胞凋亡，同时用/-tubulin作为对照。结果如图6，完全培养液中的肝癌细胞几乎没有C- PARP条带，而用CSS培养液培养的肝癌细胞中C- PARP含量明显少于其空白对照。

3讨论

 SGK3是属于AGC家族的丝氨酸／苏氨酸激酶。SGK家族有SGK1、SGK2、SGK3共3个同源异构体，三者基因分布在不同的染色体上，SGK3编码基因位于8号染色体长臂。SGK3处于磷脂酰肌醇-3羟基激酶( PI3K)下游，受PDK1等的调控。有报道SGK3也参与IL-3依赖的存活通路，目前已知其与多种分子作用，包括调控细胞生长、增殖、迁移、生存的效应器AIP4f、Fox03a、FLIII、GSK3B、BAD、NDRGI等，调节离子通道的NeDD4-2、KCNQl/KCNE、KUL.3、Kir2.1、HERG、GluRl等，此外还有很多。SGK3分子结构包括N端的Phox-ho-mology域（PX域）、中间的激酶区域和C端的疏水模体。Wang等认为SGK3在乳腺癌细胞中受雌激素水平影响，在前列腺细胞中同样受雄激素调控，改变细胞的生长、存活情况。Liu等发现SGK3在肝癌细胞中过表达，并日．伴随着糟糕的总生存率。

 一项研究中的年龄标准化发病率结果显示，全球肝细胞癌发病率在男性中高于女性。除地域等因素外，该比值为2：1—4：1。而在大鼠的动物实验中，性别的差异更明显。部分乙肝阳性的患者报告中，这一比率可高达7：1。临床资料显示，这种发病率高峰还出现在绝经后女性病人中。原发性肝细胞癌中这种性别的差异，揭示着性激素及其受体可能参与了肝细胞癌的发生发展。有研究证明，雄激素可以刺激和促进肝癌细胞生长，在双氢睾酮(DHT)作用下，肝癌细胞的生长呈现剂量依赖性关系。此外，在多数肝癌和周边组织中都可以检测到雄激素受体，雄激素受体阳性伴随着更高的癌症复发率和糟糕的预后。雄激素及其受体参与肝癌细胞的发生发展，可能与其参与的TGF-B1的上调、p53的抑制、B1整合素的上调、PI3 K/AK'r通路的激活、CCCRK(cell cycle-related kinase)的上调、3-catenin/TCF信号的激活、VEGF/Stat3信号通路的激活、转移促进基因ID1的激活等相关，在乙肝患者中，雄激素的激活效应可以被HBx蛋白放大。现有证据充分说明雄激素受体在肝癌细胞中的促进作用。

 经活性炭一葡聚糖处理，可去除血清中的甾体类激素，如雄激素、雌激素、甲状腺激素等，该方法广泛用于探究前列腺癌细胞与雄激素及其受体关系的试验中。本实验中用Western印迹检测到BEL- 7402细胞株中有雄激素受体的表达，没有发现雌激素受体的表达（数据略），实验中证实BEL-7402肝癌细胞在去甾体激素的血清中生长受到抑制。

 多聚二磷酸腺苷核糖聚合酶(uLy ADP-riboseuLumerase，PARP)的相对分子质量为l16xl03，参与DNA的损伤修复和细胞程序性死亡，在体内是Cas-pase-3的主要裂解靶向蛋白之一。PARP的裂解(cleavage of PARP)促进细胞崩解并可以作为细胞凋亡的标记物。实验中BEL-7402细胞在去甾体激素FBS中培养4d后C-PARP含量明显增高，说明伴随着明显的细胞凋亡。而过表达SGK3的BEL-7402肝癌细胞在去甾体激素FBS中C-PARP含量较过表达空质粒的空白对照组明显减少，说明过表达SGK3的BEL-7402细胞可以抵抗其在去甾体激素FBS中的凋亡。

 我们的实验完成了稳定过表达SGK3的BEL-7402肝癌细胞系的建立，证实BEL-7402肝癌细胞在去甾体激素的血清中生长受到抑制，发现过表达SGK3的BEL-7402肝癌细胞在去甾体激素血清培养条件下具有抗凋亡能力。这为今后深入探讨肝细胞癌以及相关肿瘤的临床治疗提供了一定的基础。