牛琳，段永娟，王文天，杨洋，赵慧娟，胡晓
中国医学科学院北京协和医学院血液学研究所血液病医院，实验血液学国家重点实验室，天津300020
——
[摘要]目的：构建转录辅助因子LBH(limb-bud and heart)过表达的人间充质干细胞(MSC)株，研究Lbh基因对人MSC功能的调控。方法：通过分子克隆的方法构建人Lbh基因的慢病毒表达质粒pCDHP-/bh，经限制性内切酶酶切和核酸测序鉴定，利用293T细胞包装表达Lbh基因的慢病毒及对照；将包装的病毒感染人MSC，利用表达载体携带的GFP报告基因，采用流式细胞术分选GFP阳性目的细胞；通过油红0染色鉴定阳性细胞的成脂分化能力，通过茜素红和硝酸银染色鉴定阳性细胞的成骨分化能力。结果：双酶切和测序结果表明正确克隆了人Lbh基因的全长CDS序列，定量PCR和Western印迹结果表明构建的pCDHP-/bh重组质粒能够表达Lbh基因；流式分选获得LBH稳定表达的人MSC细胞株，该细胞株经成骨和成脂诱导分化培养后，油红0染色、茜素红染色和硝酸银染色结果均呈阳性。结论：构建了人Lbh基因的慢病毒表达质粒pCDHP-/bh，并获得稳定表达Lbh基因的人MSC细胞株，该细胞株保留了向脂肪细胞和成骨细胞定向分化的能力。本研究为迸一步探讨Lbh基因对人MSC功能的调控提供了重要的实验基础。
[关键词] limb-bud and heart；转录辅助因子；人间充质干细胞；慢病毒载体
LBH(limb-bud and heart)是一种转录辅助因子，其基因属于序列高度保守的编码基因，在胚胎肢体和心脏发育中具有时空表达特异性。研究指出，LBH对肢体、心脏和软骨内成骨发育过程具有重要影响。在软骨成骨分化过程中，LBH可能通过抑制Runx2和血管内皮生长因子(VEGF)的表达而负调控部分血管浸润和早期骨化中心的形成。因此，LBH在成软骨发育过程中起着重要的作用。间充质干细胞(mesenchymal stem cell，MSC)来源于胚胎发生期的中胚层，在体内和体外具有分化为成骨细胞、软骨细胞、脂肪细胞和神经胶质细胞等潜力。同时，MSC可进行有效的体外扩增，可诱导分化为多种组织细胞，特别是中胚层和外胚层的组织细胞，是一种具有多分化潜能及自我复制功能的早期未分化细胞。目前，Lbh基因对MSC功能的影响未见研究报道。在本研究中，我们构建了pCDHP-/bh重组质粒，在MSC中对其进行稳定表达，并初步探讨其对MSC向成脂成骨分化能力的影响。
1 材料与方法
1.1材料
MSC由本室分离并保存；293T细胞购自ATCC，由实验血液学国家重点实验室提供；pCDHP载体由本实验室构建；限制性内切酶购自NEB公司；dNTP和Taq DNA聚合酶购白TaKaRa公司；快速连接试剂盒购自Thermo Scientific公司；中量质粒提取试剂盒和3- actin抗体（兔源）购自康为世纪公司；Lipo-fectAMINE 2000、TRIzol、逆转录试剂盒、PlatinumSYBR Green qPCR SuperMix-UDG和琼脂糖购自Invitrogen公司；LBH抗体（兔源）购自Abcam公司；二抗（鼠抗兔）购自Jackson公司；DMEM/F12培养基、低糖DMEM培养基和胎牛血清(FBS)购自Gibco公司；油红O(oil red O)、茜素红(alizarin red)和硝酸银(von Kossa)购自Sigma公司。
1.2 pCDHP-/bh重组质粒的构建与鉴定
根据人Lbh序列设计上游引物(5，-CGACTATCTGAGATCGGCCA- 3')和下游引物（5 ’一GTCCTTCA GTTTGCAGCAGC-3'），并在上、下游引物的5 ’端分别添加Xba I、Not I酶切位点。以K562细胞cDNA为模板进行PCR扩增（反应条件：940C1 min，以94。C 71 s、65C 39 s、72。Clmin进行39个循环，72C5 min)。
将PCR产物行10 g/L琼脂糖凝胶电泳，条带位置正确且产物特异后，用限制性内切酶Xba I、NotI酶切，酶切后的产物与pCDHP载体连接，连接产物经转化及克隆扩大培养后中量提取质粒，用限制性内切酶Xba I、Not I酶切鉴定并测序。
1.3慢病毒的包装
将293T细胞接种于10 cm皿中，当细胞密度达70%—80%时，将慢病毒包装系统中的pLPl、pLP2、pLP-VSVG和pCDHP-/bh质粒按照一定比例混合，加入Opti-MEM混匀；将LipofectAMINE 2000与Op-ti-MEM混匀，室温孵育5 min；然后将上诉混合液和慢病毒包装系统混合，室温孵育20 min后转染293T细胞，48 h后收集含病毒粒子的上清，离心、过滤后置4℃或-80qC保存。
1.4稳定表达LBH的MSC细胞株的构建
将第6代MSC接种于6 cm皿中，加入包装好的病毒液，同时加入8 p4g/mL的Polybrene促进病毒转染。感染8h后更换新鲜培养基，扩大培养后进行流式细胞术分选，获得pCDHP-MSC细胞和pCDHP-/bh-MSC细胞。次日于荧光显微镜下观察流式细胞术分选后的阳性目的细胞。
1.5 MSC成脂成骨诱导分化及鉴定
取第7代pCDHP- MSC细胞和pCDHP- Lbh-MSC细胞接种于12孔板中，加入成脂诱导培养基，并在诱导后的14 d进行油红0染色鉴定诱导效果。油红0染色：先去除细胞培养液，用PBS洗3次，10%甲醛室温固定20 min，用PBS洗3次，加入0.5%油红0染液，37℃染色30 min，之后用PBS充分洗涤，于40x物镜的倒置显微镜下拍照。
取第7代pCDHP- MSC细胞和pCDHP- Lbh-MSC细胞接种于12孔板中，加入成骨诱导培养基，并在诱导后的21 d进行茜素红和硝酸银染色鉴定诱导效果。茜素红染色：先去除细胞培养液，用PBS洗3次，10%甲醛室温固定20 min，用超纯水洗3次，加入0.5%的茜素红染液，37℃染色10 min，之后用超纯水充分洗涤，于40x物镜的倒置显微镜下拍照。硝酸银染色：先去除细胞培养液，用PBS洗3次，10%甲醛室温固定20 min，超纯水洗3次，加入5%的硝酸银染液，37。C染色th，之后用超纯水充分洗涤，紫外线照射1～2 h，于40x物镜的倒置显微镜下拍照。
2结果
2.1 pCDHP-/bh重组质粒的构建及鉴定
利用PCR扩增人Lbh CDS序列，经琼脂糖凝胶电泳检测，在约318 bp位置出现与预期结果一致的电泳谱带（图1A）；pCDHP-/bh重组质粒用Xba I、Not I双酶切后进行琼脂糖凝胶电泳，出现8196和318 bp的条带，符合预期结果（图1A）。将阳性克隆测序，结果与GenBank库中相应序列完全匹配，证明扩增的Lbh,基因序列没有发生突变（图1B）。在293T细胞里瞬时转染pCDHP-/bh重组质粒，72 h后进行Western印迹检测，结果表明构建的pCDHP-Lbh重组质粒可以过表达LBH蛋白（图1C）。
2.2 LBH稳定表达的MSC细胞株构建
用包装好的pCDHP-/bh慢病毒感染MSC，96 h后上机进行流式细胞术分选，获得GFP阳性目的细胞（图2A）；在荧光显微镜下可观察到流式细胞术分选后的阳性目的细胞有绿色荧光信号（图2B）。用定量PCR方法检测pCDHP- MSC细胞和pCDHP-Lbh- MSC细胞中Lbh基因的表达水平，结果显示pCDHP- Lbh- MSC细胞中Lbh基因表达水平比pCDHP-MSC细胞提高了近85倍（图2C）。
2.3 MSC的成脂成骨诱导分化及鉴定
将pCDHP-MSC细胞和pCDHP-/bh-MSC细胞进行成脂诱导分化，分化后14 d进行油红0染色，结果呈阳性，表明pCDHP-/bh.- MSC细胞株可向脂肪细胞定向分化（图3A）。将pCDHP-MSC细胞和pCDHP-/bh-MSC细胞进行成骨诱导分化，分化后21 d分别进行茜素红染色（图3B）和硝酸银染色(图3C)，结果呈阳性，表明pCDHP-/bh,- MSC细胞株可向成骨细胞定向分化。
3讨论
2001年，BriegelI c)等首先在小鼠中克隆了Lbh基因。Lbh基囚位于2号染色体2p23.2，其编码的LBH蛋白是包含105个氨基酸残基的核蛋白，N端为疏水区，中问含一个核定位信号，C端为富含谷氨酸盐的酸性结构域。2007年，艾建平等首次克隆了人类的Lbh基因，并报道其位于人染色体2p23区，基因长28.5 kb，编码的人LBH蛋白有105个氨基酸残基，预测相对分子质量为16.2×103。后续研究发现，LBH有可能与其他已知基因协同，在肢体、心脏和软骨内成骨发育过程中发挥重要作用。越来越多的研究表明LBH影响着多种疾病的发生。MSC是一类具有多向分化潜能及自我更新能力的组织干细胞，是成骨细胞和脂肪细胞的主要来源。MSC向成骨方向分化能力减弱、向成脂方向分化能力增强是导致老年人发生骨质疏松等疾病的主要原因之一，因此深入研究MSC分化功能及其调控网络是非常必要的。在本研究中我们通过高保真PCR扩增/b/z的全长CDS序列，连接至pCDHP慢病毒表达载体，构建pCDHP-/bh稳定表达重组质粒，在293T细胞中包装pCDHP-/bh慢病毒并感染MSC，采用流式细胞术分选GFP阳性目的细胞，通过油红0染色证明阳性细胞保留了成脂分化能力，通过茜素红和硝酸银染色证明阳性细胞保留了成骨分化能力。
2009年，Conen等报道软骨细胞和破骨细胞中过表达LBH显著降低了Runx2和VEGF的表达水平，而LBH过表达造成的骨发育障碍能被Runx2的同时过表达挽救。2014年，Powder等报道，LBH通过调控神经嵴细胞的发育而影响颅面骨骼形成。1 966年，MSC首先被Friedenstein与Petrakova从大鼠骨髓中分离获得，且证实其具有向成骨细胞分化的潜能。因此，我们构建的pCDHP-/bh慢病毒表达质粒及筛选获得的稳定过表达LBH的MSC，为进一步研究/bh基因对MSC分化功能的调控及相关分子机制提供了重要的实验基础。
下一篇:返回列表
