宋玉华，陈滢洁，张亚楠，刘婕，罗晓丽，贾晓蒙，李欣，姜潇，丁丽华，叶棋浓
1．青岛大学附属医院乳腺中心，山东青岛266003；
2．军事医学科学院生物工程研究所，北京100850
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[摘要]目的：构建Twistl的慢病毒真核表达载体，并建立稳定表达Twistl的乳腺癌细胞株，研究Twistl在乳腺癌中对上皮一间充质转变(EMT)的影响。方法：以乳腺文库为模板，PCR扩增Twistl编码序列，克隆到慢病毒pCDH载体，构建成pCDH-Twistl，转染293T细胞，Western印迹鉴定pCDH载体介导的Twistl的表达；包装病毒载体，感染ZR75-1细胞，用嘌呤霉素筛选得到稳定表达Twistl的细胞株，检测ZR75-1细胞对EMT的影响。结果：经BamH I、EcoR I双酶切及测序证实得到pCDH-Twistl表达载体，Western印迹实验发现Twistl在293T细胞内表达；嘌呤霉素筛选得到稳定表达Twistl的ZR75-I细胞株。结论：构建了pCDH-Twistl的真核表达载体并建立了稳定表达Twistl的ZR75-1细胞，为进一步研究Twistl在EMT过程中的机制奠定了基础。
[关键词]Twistl；E-钙黏蛋白；上皮一间充质转变；乳腺癌细胞
乳腺癌是当今严重影响妇女身心健康甚至危及生命的恶性肿瘤，近年来其发病率逐年上升，并且出现发病倾向年轻化的趋势，给乳腺癌的治疗及其预防提出了新的挑战。由于它的发病机制并未完全阐明，因此探索相关基因及致病机制，寻找特异有效的临床治疗靶点是解决问题的关键。随着人们对乳腺癌发生、发展的深入研究发现，肿瘤上皮细胞发生上皮一间充质转变( epithelial- to- mesenchymaltransi-tion，EMT)在乳腺癌的发生和发展中起着至关重要的作用。EMT是研究肿瘤进展的重要因素，人类的乳腺癌细胞经过EMT的诱导，可以使其表现出多向分化和自我更新的能力，有利于使肿瘤细胞脱离原发灶，获得侵袭能力，发生远处侵袭和转移。EMT主要以上皮细胞极性丧失及间质极性的获得为主要特征，表现为间叶细胞表型标志物如N-钙黏蛋白、波形蛋白、a-平滑肌肌动蛋白和细胞外基质胶原蛋白a1、a2等的表达上调；上皮细胞标志物如E-钙黏蛋白、骨架蛋白、连接蛋白、B-连环素、a-连环素等表达下调；同时诱导EMT的细胞因子如Snail、Slug、Twistl及成纤维细胞因子和转化细胞生长因子的上调。肿瘤的发生和发展的全过程有多种因素共同参与，Twistl作为调节EMT过程中的关键因子，对肿瘤的发生发展和转移，以及肿瘤治疗、预后有非常重要的影响。Twistl的过表达可以使肿瘤细胞抗凋亡的能力增强，抑制分化，加速细胞周期，从而导致肿瘤的转移和浸润。同时，最新研究发现，Twistl的过量表达可以导致E-钙黏蛋白的表达减弱甚至丧失，从而导致肿瘤的发生和转移。为进一步研究Twistl的过量表达在乳腺癌发生和发展过程中对E-钙黏蛋白表达的影响，我们从乳腺cDNA文库中获得了Twistl的全长编码序列，构建了Twistl过表达的真核表达载体。人胚肾的293T细胞转染效率高，常用来检测真核基因的表达；慢病毒表达载体感染效率高，易得到稳定克隆。因此，我们将构建的pCDH-Twistl真核表达载体转染293T细胞，检测其表达，并在ZR75-1细胞中利用慢病毒系统建立了稳定表达Twistl的乳腺癌细胞。我们的研究为进一步检测Twistl过量表达对乳腺癌细胞EMT的影响，以及在乳腺癌发生和发展中的作用机制奠定了基础。
1 材料和方法
1.1材料
293T、ZR75-1细胞由本实验室传代培养；载体为本实验室所有；VigoFec由威格拉斯生物技术有限公司生产；限制性内切酶BamH I、EcoR I，LA Taq酶和T。DNA连接酶均购自TaKaRa公司；质粒提取、胶回收和PCR回收试剂盒为Promega公司产品；DMEM及小牛血清购于Gibco公司；PCR引物及测序由天一辉远公司生产完成。
1.2 pCDH-Twistl真核表达载体的构建
根据GenBank中的Twistl序列(登陆号为NM_000474)设计用于PCR扩增的上游引物(5，-CGGGATCCATGATGCAGGACGTGTCCA- 3-)和下游弓I物(5'- CGGAATTCCTAGTGGGACGCGGACAT-3 ’)，以乳腺文库为模板，用LA Taq酶进行PCR扩增（反应条件：95℃变性1 min；95℃变性30 s，58。C复性30 s，72C延伸50 s，29个循环；72。C再延伸7 min），扩增片段为608 bp。扩增产物经琼脂糖凝胶电泳，经BamH I、EcoR I双酶切回收Twistl基因，与经同样双酶切的pCDH表达载体按一定比例用T。DNA连接酶于16。 C连接8h，连接产物转化大肠杆菌DH5a感受态细胞，次日挑取平板上的克隆至500 V,L LB培养基中，37。C振荡培养12 h，经菌液PCR鉴定，阳性克隆经BamH I、EcoR I双酶切鉴定并测序。
1.3 细胞转染和Western印迹检测
将上述构建的pCDH-Twistl真核表达载体和空载体pCDH转染293T细胞，24 h后收集细胞，用1×PBS洗2次，3000 r/min离心5 min，弃上清，在细胞沉淀中加入2～3倍细胞量的蛋白缓冲液( RIPA)，于冰上裂解30 min，加入2xSDS上样缓冲液充分混匀，煮沸I5 min，12 000 r/min离心5 min后取上清液进行SDS-PAGE(85 V 15 min，130 V 50 min)，电泳结束后用半干法电转50 min，将蛋白胶上的蛋白转移至硝酸纤维素膜上，再用TBST配制5%脱脂奶粉封闭1 h或4℃封闭过夜，随后用5%脱脂奶粉稀释一抗(GAPDH l:3000，Twistl 1：200) 4C孵育过夜，次日用TBST洗膜3次，每次5—7 min，后加入用5%脱脂牛奶1:5000稀释的鼠抗1gG抗体，室温轻摇2h，TBST洗膜3次，每次5 min，将显影剂A液和B液按1:1混匀并附膜反应I5 min后显影。
1.4稳定克隆的筛选
将293T细胞接种于6孔板，待细胞生长至密度为600/0—70%，将3种包装质粒0.84 p4g pLPl、0.4ht,9 pLP2及0.56 ug VSVG分别与1ug构建的重组质粒pCDH-Twistl和空质粒pCDH混匀后于200 uL无血清无双抗的DMEM中，分别加入10 pdL Mega-tran转染试剂，涡旋振荡10 s混匀，室温静置10min，后将上述混合物加入接种好的293T细胞培养基中，4h换液，48 h后收集上清，将上述包好的病毒加入已接种于6孔板的细胞密度约为70%的ZR75-1细胞中，每孔约500 uL，24 h后换液，48 h后每孔按照1：1000加入2ug/mL的嘌呤霉素进行筛选，按时观察，待细胞死亡较多时更换培养基继续培养，并增加嘌呤霉素用量继续筛选，待细胞数量不再减少时即可得到稳定的混合克隆。
1.5 Western印迹检测pCDH-Twistl对EMT的影响
将上述筛选的携带慢病毒真核表达载体的ZR75-1细胞接种于6 cm皿中，待细胞融合至90%左右时收集细胞，用lxPBS洗2次，离心弃上清，加入2xSDS加样缓冲液，煮沸15 min，离心后取10-15 uL上清蛋白进行SDS-PAGE，结束后转移至硝酸纤维素膜上，转膜后用5%脱脂奶粉于4℃封闭1h，然后加入用5%脱脂奶粉稀释的Twistl(1:200)抗体、E-钙黏蛋白(1: 200)抗体或GAPDH(I:1000)抗体，4℃封闭过夜，次日用TBST洗膜3次，每次5min，加入用5%脱脂奶粉以1：2000稀释的鼠抗IgG抗体，室温轻摇2h，TBST洗膜3次，每次5 min，用化学发光法显色5 min，压片显影。
2结果
2.1 Twistl的PCR扩增
以乳腺文库为模板，PCR扩增Twistl全长编码序列，长度应为608 bp，DNA凝胶电泳结果与预期大小相符（图1）。
2.2 pCDH-Twistl载体的构建
将PCR扩增的Twistl编码序列和pCDH载体分别经BamH I和EcoR I双酶切处理，经连接、转化，抗性筛选得到的重组质粒经PCR鉴定为阳性（结果未示）。将鉴定为阳性的质粒用BamH I和EcoR I双酶切，在608 bp处可见特异片段，而空载体无此特异条带（图2）。以I二结果表明pCDH-Twistl真核表达载体构建成功。
2.3 pCDH-Twistl在293T细胞内的表达鉴定
将L述阳性克隆提取质粒后转染293T细胞，对照组转染pCDH空载体，48 h后收细胞，Western印迹检测细胞内Twistl的表达，以GAPDH为内参，结果见图3。转染pCDH-Twis,tl真核表达载体的细胞中表达相对分子质量约25x10'的一条特异性条带，对照组明显减弱，与预期结果相符，表明载体携带的pCDH-Twistl编码序列能够在293T细胞中过表达。
2.4建立ZR75-1稳定克隆并检测对EMT的影响
收集上述经嘌呤霉素筛选的751-pCDH-Twistl及751-pCDH细胞稳定克隆，Western印迹检测细胞pCDH-Twistl对E-钙黏蛋白因子的影响，以GAPDH为内参。结果见图4，E-钙黏蛋白抗体在细胞中表达约相对分子质量约100XIO'的相对于对照组减弱的条带，与预期结果相符，表明pCDH-Twistl载体可以使细胞中E-钙黏蛋白的表达减弱。
2.5 pCDH-Twistl可通过调节EMT使细胞变形获得迁移和生存。
将上述通过鉴定的751-pCDH-Twistl和751-pCDH稳定克隆细胞株分别传代至6 cm皿，记录观察细胞形态的变化。2周时对照组细胞兀明显变化；751-pCDH-Twistl细胞株细胞形态发生变化，细胞胞体积略增大，细胞形态变得细长，呈菱形和三角形，利于细胞获得浸润迁移的能力（图5）。
3讨论
现已发现Twistl在胃癌、乳腺癌、成神经细胞瘤、神经胶质瘤、食管癌、横纹肌肉瘤、胰腺癌和结直肠癌等表达异常，但对于Twistl的研究在乳腺癌中更为深入。TWistl的表达上调不仅涉及到乳腺癌的发生和发展过程，在乳腺癌的浸润侵袭、淋巴结转移及肿瘤分期等方面也同样重要。最早是在细胞周期及细胞凋亡中认识到Twistl的作用。体外实验证实，Twistl基因与EMT现象及肿瘤转移有很大的相关性。此外，在肿瘤血管生成及耐药等方面Twistl也都参与其中。Twistl参与了某些上皮来源的肿瘤细胞发生EMT并促进其侵袭与转移。Twistl可以通过影响肿瘤细胞的凋亡，抑制分化，从而在肿瘤的发生和发展过程中起重要作用。Twistl的表达上调可以导致癌细胞出现干细胞样特性，比如肿瘤球的形成及肿瘤的成管等。Florian等指出，EMT是肿瘤进展的重要步骤，Twistl作为胚胎发育基因参与了EMT的全过程。Twistl作为一种转录因子可作用于E-钙黏蛋白上游合成的过程，从而抑制其表达，促进肿瘤细胞的侵袭和转移。Twistl过表达可以使肿瘤细胞中E-钙黏蛋白表达下调，降低了肿瘤细胞发生凋亡的概率，从而促进了肿瘤细胞从原发部位脱落，侵入周围组织，导致肿瘤细胞的浸润与转移。最新研究表明，发育中的EMT显而易见的特点是诱导细胞极性紊乱，破坏基底膜，从而增加细胞的可塑性，使细胞的迁移能力增强，而这一系列过程均与上皮黏附素E-钙黏蛋白向神经黏附素N-钙黏蛋白转换有关。
综上，我们构建了Twistl过表达的克隆质粒pCDH-Twistl，并建立了稳定表达Twistl的乳腺癌细胞株，发现Twistl过表达可以通过调节E-钙黏蛋白表达使乳腺癌细胞发生EMT。这有助于进一步探讨乳腺癌的治疗，同时为深入研究Twistl过表达在肿瘤发生、发展中的作用机制开辟了新的道路，也为临床分子靶向治疗奠定了基础，为肿瘤患者带来了新的希望。
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