张晶，赵兴然，张群，李清扬，王向红*
河北农业大学食品科技学院(保定071000)
摘要建立了动物源性食品中常用的头孢羟氨苄、头孢氨苄、头孢噻肟、头孢拉定和头孢唑啉5种头孢类抗生素的高效液相色谱法。样品经乙腈水溶液提取，过固相萃取柱净化，以磷酸盐缓冲液与甲醇(80：20)为流动相，对5种头孢类抗生素进行了分离测定，5种头孢类抗生素可在50 min内分离，最低检测限均可达到10 μg/kg。六种动物源性食品中检测5种药物的回收率均在70.05%~95.51%之间，精密度为2.72%。该方法简单、灵敏、可靠，适用于动物源性食品中头孢类抗生素残留的分析确证。
关键词 高效液相色谱；头孢类抗生素；动物源性食品
头孢菌素是继青霉素之后在自然界发现的又一类β一内酰胺类抗生素，由于其具有抗菌谱广、抗菌作用强、临床疗效高、不良反应较少等特点，广泛应用于医学及兽医临床上。用其治疗动物呼吸道感染、细菌感染等疾病时，不可避免地引起在动物组织及其制品中的残留，给人类食品安全带来危害。因此，世界各组织及各国纷纷制定食品中抗生素残留标准。2001年和2002年，我国农业部又先后公布了“无公害食品生鲜牛乳”( NYIT 5045-2001)、 “无公害食品灭菌乳”（NY 5141-2002）和“无公害食品巴氏杀菌乳”( NY 5140-2002)等行业标准，规定了“抗生素不得检出”。美国FDA针对使用广泛的头孢类抗生素发布部门规定：从2012年4月5日开始，禁止给牛、猪、火鸡使用头孢类抗生素。韩国2011年的7月1日起，全面禁止动物饲料中添加抗生素。然而，为适应市场与医疗的需要，每年都有许多更有效且更广谱的头孢菌素被开发出来。因此，建立该类药物的分析检测方法对于食品安全具有重要的意义。
目前关于动物源性食品中抗生素残留的检测方法主要有：微生物检测法、免疫检测法、理化检测方法等。微生物检测法具有可靠，成本低的优点，但存在操作时间长，过程复杂，肉眼辨别误差大等缺点；酶联免疫法具有操作简单、快速的优点，但易产生假阳性。理化检测法中的高效液相色谱法具有灵敏度高、分离效率高、应用范围广、重现性好等优点，被广泛应用于药物分析。最近几年，高效液相色谱法应用于头孢类抗生素的检测，但应用高效液相色谱法测定单组分头孢类抗生素的报道很多，《中国药典》也有记载，但是应用高效液相色谱法同时测定几种头孢类抗生素的报道却很少，药典也没有收载。以中国药典所采用的方法为基础，建立了在同一种流动相同一色谱中分离检测动物源性食品中头孢羟氨苄、头孢氨苄、头孢噻肟、头孢拉定和头孢唑啉5种头孢类抗生素残留的高效液相色谱法。该法操作简便快速，灵敏准确。
1 材料与方法
1.1仪器与设备
Agilent 1200型高效液相色谱仪：美国安捷伦有限公司；Agilent C18色谱柱：美国安捷伦有限公司；分析天平BS214D：北京赛多利斯仪器系统有限公司：SK-1型涡旋混匀器：麒麟医仪；高速离心机：上海安亭科学仪器厂；旋转蒸发仪RE-52A：上海亚荣生化仪器厂；离心机TGL16M：长沙易达仪器公司；KQ-500DE型数控超声波清洗器：昆山市超声仪器有
限公司；固相萃取柱：Oasis HLB固相萃取柱，500 mg，6 m L: Waters公司。
1.2试剂
头孢羟氨苄、头孢氨苄、头孢噻肟、头孢拉定和头孢唑啉（纯度均≥99.0%），中国药品生物制品检定所；磷酸二氢钠、磷酸氢二钠（纯度≥99.0%）．天津市科密欧化学试剂有限公司；乙腈、甲醇，为色谱纯级；试验用水均为超纯水。
1.3标准储备液的配制
分别精密称取5种标准品各0.001 0 g，溶于1 m L甲醇溶液中，超声混匀，配制成1mg/m L的标准储备液，-20℃保存。然后用甲醇溶液逐步稀释成适当浓度的混合标准工作液。
1.4样品处理
1.4.1样品的提取
动物肝脏、肌肉组织：称取4.00 g已粉碎的样品于50 m L离心管中，加入12 m L乙腈水溶液(15：2．体积比)，均质30 s，于4℃4 000 r/min离心5 min,将清液转移至50 m L离心管中；另取-离心管，加入8 m L乙腈水溶液，洗涤均质器刀头；用玻璃棒捣碎离心管中的沉淀，加入上述洗涤均质器刀头的溶液，在涡旋混合器上振荡1 min，4 000 r/min离心5 min，上清液合并至50 m L离心管中，重复用8 m L乙腈水溶液洗涤刀头并提取一次，合并至50 m L离心管中，定容至50 m L，取20 m L人100 m L鸡心瓶。
牛奶：将牛奶样品置于离心管中，室温下4 000 r／min离心10 min，弃去脂肪层。称取4.00 g已脱脂的样品于50 m L离心管中，加入12 m L乙腈水溶液(15：2，体积比)，均质30 s，4 000 r/min离心5 min，清液转移至50 m L离心管中；另取-离心管，加入8 m L乙腈水溶液，洗涤均质器刀头；用玻璃棒捣碎离心管中的沉淀，加入上述洗涤均质器刀头溶液，在涡旋混合器上振荡1min，4 000 r/min离心5 min，上清液合并至50 m L离心管中，重复用8 m L乙腈水溶液洗涤刀头和提取一次，合并至50 m L离心管中，定容至50 m L，取20 m L人100 m L鸡心瓶。
1.4.2样品的净化
立即向已经除去乙腈的鸡心瓶中加入25 m L磷酸盐缓冲溶液( 0.05 mol/L，pH 8.5)；涡旋混匀1 min，用0.1 mol/m L氢氧化钠调节pH为8.5，以1 m L/min的速度通过经过预处理的固相萃取柱，先用2 m L磷酸盐缓冲溶液淋洗两次，再用1 m L超纯水淋洗。用3 m L乙腈洗脱（速度控制在1m L/min）。将洗脱液置于鸡心瓶中在旋转蒸发器上（45℃水浴）蒸发至除去乙腈。用甲醇定容至1 m L，过0.45μm滤膜，供HPLC分析。
1.4.3色谱条件
色谱柱：Agilent-C18色谱柱(250 mm×4.6 mm,5 μm)；流动相：磷酸盐缓冲液(50 m mol/L)：甲醇( 80：20)；检测波长：254 nm;柱温：250C;流速：0.8 m L/min;进样量：10μL 。
1.5标准曲线的绘制及最低检测限
将1mg/m L的标准储备液用甲醇稀释，得到1，2，4，8，16和32 μg/m L系列质量浓度的标液，依次进行HPLC分析。以标品浓度为横坐标，峰面积为纵坐标，绘制标准曲线，求出回归方程，并得到相关系数。以最低检出浓度计算，3倍信噪比( S/N)为最低检测限(LOD)。
1.6方法的精密度与回收率
在选定的条件下，连续7次进样质量浓度32 μg/m L的标准品，测定各组分的峰面积，计算日内精密度。在已知提取条件下对生鲜猪肉、牛肉、虾肉、牛奶、生猪肝和熟猪肝等六种动物源性食品为试验材料，进行加标回收试验，加标水平分别为10，20和40μg/kg。
2结果与讨论
2.1头孢类抗生素标准品与空白样品加标色谱图
试验以中国药典所采用的方法为基础，建立了在同一种流动相上同一次色谱中分离检测头孢羟氨苄、头孢氨苄、头孢噻肟、头孢拉定和头孢唑林的高效液相色谱法。图1为各头孢类抗生素的标准品色谱图。图2~图7为头孢类抗生素在各样品组织中的加标色谱图。
2.2标准曲线与最低检出限
各头孢类抗生素的线性回归方程见表1。5种头孢类抗生素在1～32μg/m L质量浓度范围内线性关系良好，相关系数均在0.997以上。头孢羟氨苄、头孢氨苄、头孢噻肟、头孢拉定和头孢唑啉5种头孢类抗生素的最低检出限均可达到10 μg/kg。
2.3方法的精密度和加标回收率
在选定的条件下，连续7次进样质量浓度为32 μg/m L的标准品，测定各组分的峰面积，计算日内精密度，RSD为2.72%(n=7)。在已知提取条件下对生鲜猪肉、牛肉、虾肉、牛奶、生猪肝和熟猪肝进行加标回收试验，表2~表4为各组分的加标回收率。由表可知，各组分回收率均在70.05%～95.51%之间，说明样品前处理方法可行，满足动物性食品中头孢类抗生素药物残留检测的要求。
3结论
建立了分离和检测5种头孢类抗生素的高效液相色谱法，在1～32 μg/m L范围内均呈线性关系，头孢羟氨苄、头孢氨苄、头孢噻肟、头孢拉定和头孢唑啉的线性回归方程分别为：Y=32.425X-9.527 9，Y=23.124X-8.297, Y=34.734X-13.445, Y=16.939X-5.021 9和Y=31.035X-1.629 4，相关系数均大于0.997，线性良好，最低检出限均可达10 μg/kg，相对标准偏差为2.72%，5种抗生素在动物性食品中的加标回收率均在70.05%～95.51%之间。
该方法样品处理过程简单，操作快速，分析方法重复性好，灵敏度高，精密度及回收率均可满足实际工作的要求，可适用于动物源性食品中的头孢菌素类抗生素的定性和定量检测，能够满足各国对上述头孢菌素类抗生素的最大残留量要求，具有广泛的适用性。
下一篇:返回列表
