熊加秀 丁丽华 刘文忠 张亚楠 陈志达 罗晓丽 贾小萌 陈滢洁 叶棋浓 卫勃
1．内蒙古医科大学基础医学院，内蒙古呼和浩特010059;
2．军事医学科学院生物工程研究所，北京100850;
3．解放军总医院普通外科，北京100853；
4．神华神东总医院，陕西榆林719315
[摘要]目的：构建磷酸化Aktl(Thr308)位点突变真核表达载体，并瞬时转染胃癌耐药细胞，对其生物学功能进行初步检测，方法：以带有pcDNA3．O-Flag标签的Aktl质粒为模板，采用重组PCR技术扩增得到Aktl(T308A)（苏氨酸突变成丙氨酸）、Aktl(T308E)（苏氨酸突变成谷氨酸）位点突变编码区序列，将其插入pcDNA3.0-Flag载体，双酶切和测序验证后瞬时转染人胚肾293rr细胞，Western印迹检测其表达情况；将突变质粒与空载体分别转染人胃癌耐药细胞BGC-823／(．DDP，通过Western印迹和实时定量PCR检测Notchl蛋白和mRNA水平的变化，通过CCK-8法检测对耐药细胞生长曲线的影响。结果：双酶切和测序结果表明Aktl(T308A)、Aktl( rr308E)的真核表达质粒构建成功，转染293T细胞后获得表达；转染人胃癌耐药细胞BGC- 823／cDDP后，利用实时定量PCR和Western印还证明去磷酸化Aktl( T308A)可抑制Nolchl的转录和蛋白水平，模拟持续磷酸化Aktl(T308E)升高Notchl的转录和蛋白表达；细胞生长曲线结果显示，转染Aktl (T308A)较空载体耐药细胞生长慢，而Aktl (T308E)促进耐药细胞生长。结论：PI3K/Akt与Notchl信号通路的激活在胃癌耐药的发生、发展过程中发挥重要作用？
[关键词] Aktl；Nocchl；点突变；耐药；胃癌
Aktl是细胞编码的一种相对分子质量为57xl03的丝氨酸／苏氨酸蛋白激酶，又称蛋白激酶B(PKB)，是磷脂酰肌醇3-激酶(PI3K)IA型最重要的下游分子，在细胞生长、分化、凋亡，肿瘤转移，血管形成和抵抗化疗、放疗等方面起重要作用。研究表明，PI3K/Akt信号转导通路广泛参与肿瘤耐药的发生、发展M。Jiao等研究发现化疗药物能通过激活的PI3K/Akt信号通路，提高磷酸化的Akt水平，下调乳腺癌细胞对化疗药物的敏感性。Abdul等在MRP1介导的结肠腺癌耐多柔比星HT29RDB细胞中，发现PI3K特异性阻滞剂LY294002可以增加多柔比星的敏感性，发挥逆转耐药作用。LY294002还可以抑制耐药细胞中Notchl蛋白表达。最近研究发现，PI3K/Akt/mTOR信号通路的激活与Notchl蛋白关系密切。Hales等已证实Notchl还可以通过Aktl( Thr308)下游基因PP2A使Thr308去磷酸化。Noichl调控上皮间充质转化，促进肿瘤干细胞形成，导致肿瘤抵抗化疗药物治疗，可作为肿瘤耐药的分子机制。
目前，关于PI3 K/Akt与Notchl信号通路的激活调控胃癌耐药的机制尚不明确。我们将磷酸化Aktl( Thr308)位点进行点突变后克隆至pcDNA3.O-Flag真核表达载体，检测磷酸化Aktl( Thr308)位点突变在胃癌耐药细胞中的生物学功能及其对Notchl蛋白的影响，为研究PI3 K/Akt与Notchl信号传导通路的激活影响胃癌耐药的发生、发展奠定基础。
1 材料与方法
1.1材料
人胃癌耐药细胞BGC-823/cDDP、人胚肾293T细胞、大肠杆菌DH5a均由军事医学科学院生物工程研究所保存并传代培养；pcDNA3.0- Flag- Aktl、pcDNA3.O-Flag载体为本室保存；DMEM培养基购自GIBCO公司；新生牛血清由浙江天杭生物科技有限公司生产；高效真核转染试剂盒Lip02000购自上海慧颖生物技术有限公司；BamH I和EcoR I限制性核酸内切酶、高保真pflL DNA聚合酶、T3DNA连接酶、PCR试剂均购白TaKaRa公司；质粒提取、胶回收纯化、PCR和酶切产物回收试剂盒为Promega公司产品；HRP标记的Flag抗体购白Sigma公司；兔抗人Akt、p-Akt308、Notchl、Hesl抗体购自Abcam公司；兔抗人GAPDH购白Santa Cruz公司；Western印迹发光检测试剂盒为威格拉斯生物技术有限公司产品；引物由北京赛百盛生物技术有限公司合成；测序由北京天一辉远生物科技有限公司完成。
1.2 Aktl(T308A)、Aktl (T308E)位点突变编码区序列的扩增
根据NCBI公布的Aktl的cDNA编码区(CDS)全长序列，设计引物（表1），PCR扩增Aktl( Thr308)位点突变的CDS序列。扩增条件：95C预变性5min；95℃变性30 s，580C退火30 s，72CC延伸2 min，30个循环；72C再延长7 min。使用高保真pfu DNA聚合酶。
1.3 Aktl(T308A)、Aktl( T308E)位点突变质粒的构建和鉴定
将PCR产物行13 g/L琼脂糖凝胶电泳，若条带特异且位置正确，则胶回收PCR产物，用BamH I和EcoR I双酶切，形成带粘性末端的双链，与经同样双酶切的pcDNA3.O-Flag载体用T4DNA连接酶连接，取连接产物7.5 pdL转化大肠杆菌DH5a感受态，随后挑克隆于5 mL LB培养基（含氨苄西林）中，370C振荡培养4～6 h，菌液PCR筛选阳性克隆，振荡培养并提取质粒，再用BamH I和EcoR I双酶切鉴定，将鉴定正确的克隆送北京天一辉远生物科技有限公司测序。
1.4质粒瞬时转染哺乳动物细胞
用含1%双抗及10%胎牛血清的DMEM培养基将人胚肾293T细胞接种于6孔板中，接种量以转染时70%～80%的细胞密度为宜，转染前l h换液。将4uL Lip02000与200 uL NaCl混合，静置5 min，期间将5 ug质粒与200 uL NaCl混合，然后将上述2种溶液混匀，室温静置15 min后加入6孔板中；以同种方法转染pcDNA3.O-Flag载体作为对照。370C、5% C02常规培养，4—6 h后换新鲜DMEM培养基，24—48 h后收细胞。
1.5Western印迹检测
细胞转染24—48 h后收集细胞总蛋白。用1×PBS洗1次，3000 r/min离心5 min，弃上清，在细胞沉淀中加入2—3倍细胞量的蛋白缓冲液( RIPA)，于冰上裂解30 min，并加入2xSDS上样缓冲液混匀，煮沸10～15 min，12 000 r/min离心2 min，取上清液进行SDS-PAGE，电泳结束后用半干法电转1 h，将蛋白胶上的蛋白转移至硝酸纤维素膜上，再将硝酸纤维素膜用TBST配制的5010脱脂奶粉封闭th或4℃封闭过夜，随后用5%脱脂奶粉稀释的一抗( GAPDH1:1000, p- Akt308、Notchl、Hesl l:500)孵育，室温下在摇床上轻摇1—2 h或4℃孵育过夜，TBST洗膜3次，每次5～7 min，加入用5%脱脂奶粉稀释的相应二抗(1: 3000)（若一抗用HRP标记，无需二抗），室温轻摇孵育1 h，TBST洗膜3次，每次5~7 min，最后用化学发光法显色5 min，压片显影。
1.6 RNA提取及实时定量PCR
取6 cm皿里融合度为100%的细胞，弃培养基，用lxPBS洗涤，用500 V,L TRIzol溶液吹下细胞，室温静置5 min，加0.2 mL氯仿提取蛋白混匀，室温静置2—3 min，4℃、12 000 r/min离心10 min，小心取上清液0.4 mL，加等量异丙醇混匀，- 20。C冷冻10min，4℃、12 000 r/min离心10 min，弃上清，用1mL 75%乙醇（DEPC水稀释）洗1次，4℃、12 000 r／mm离心5 min，弃上清，用无水乙醇洗1次，高速离心后去上清，自然干燥RNA约30 min，加入20 VLDEPC水溶解沉淀，测吸光度D值定量RNA浓度。
取总RNA 2p4g，与0.5 Vg oligo(dT)随机引物混匀，补水至15.9 VL，70CC解链5 min，自然冷却至室温，加入反转录酶、dNTP、RNA酶抑制剂及反转录缓冲液，补水至终体积25 V,L，42。C反应th，95℃灭活5 min，得到反转录的cDNA第一链。将得到的cDNA按1：20稀释，取1uL模板、10yL 2xSYBRl和上、下游引物各0.4 rLL混匀，用RT-PCR仪分别扩增Notch1 cDNA（正向引物：5，-TGCCGAACCAATACAACCCTC-3-；反向引物：5／-TGCTAGCTCATCATCTGGGACA-3'）和3-actin内参基因引物对照cDNA(正向引物：5，-ATCACCATTGGCAATGAGCG-3-；反向引物：5，- TTGAAGGTAGTTTTCGTGGAT- 3')，所得数据按2-AAC1公式计算出基因表达的相对量。
1.7 生长曲线实验
取对数生长期的细胞接种于96孔板中，每孔2000—3000细胞，每组设3个复孔，37。C、5%CO2培养箱孵育，分别在12、24、48、72、96 h时加入CCK-8（1/10溶于DMEM中），继续孵育th后，用酶联免疫检测仪测定D450nn，值，以培养时间为横坐标、平均D450mn值为纵轴坐标绘制细胞增殖曲线。
2结果
2.1 pcDNA3.O-Flag-AktI(T308A)、Aktl(T308E)位点突变质粒的构建与鉴定
以实验室保存的pcDNA3.0- Flag-Aktl质粒为模板，PCR扩增Aktl (T308A)、Aktl (T308E)位点突变的CDS序列，先获得929、513 bp片段，后重叠连接获得长约1442 bp的DNA片段，与预期大小一致（图1）。将PCR产物用Bam,H I和EcoR I双酶切后与经同样双酶切的pcDNA3.O-Flag载体连接，转化大肠杆菌DH5a，挑选克隆进行菌液PCR鉴定，获得与目的条带1442 bp接近（图2）的克隆，初步认为是带有Aktl(T308)位点突变的阳性克隆。将所得阳性克隆提质粒，经酶切鉴定，可切出2条长度分别约为5000和1442 bp的条带，而相应的空载体酶切只见大片段，符合预期结果（图2）。DNA序列测序结果表明，插入片段的DNA序列与Aktl( Thr308)位点突变的CDS序列完全一致（图3）。
2.2 pcDNA3.O-Flag-Aktl(T308A)、Aktl (T308E)位点突变质粒表达效果的检测
将构建的pcDNA3.O-Flag-Aktl (T308A)、Aktl(T308E)位点突变质粒和野生型pcDNA3.0- Flag-Aktl质粒及pcDNA3.0- Flag空载体分别瞬时转染293T细胞，24—48 h后提取细胞蛋白进行SDS-PAGE．Western印迹检测位点突变的表达。结果显示（图4），转染突变质粒后，用Flag-HRP抗体能够在相对分子质量约57xi03处检测到明显的特异性条带，空载体无条带，说明位点突变真核表达载体能在293T细胞中正确表达。
2.3 磷酸化Aktl (Thr308)位点突变对Notchl转录和蛋白水平的影响
用高效真核转染试剂Lip02000，将pcDNA3.0-Flag-Aktl、Aktl (T308A)、Aktl (T308E)和空载体瞬时转染人胃癌耐药细胞BGC-823/cDDP，采用qRT-PCR和Western印迹检测耐药细胞中Notchl mRNA和蛋白的表达水平。结果显示（图5），与转染空载体相比，去磷酸化pcDNA3.O-Flag-Aktl (T308A)明显下调Notchl的mRNA水平，而模拟持续磷酸化pcDNA3.O一Flag-Aktl(T308E)升高Notchl的转录水平，与野生型pcDNA3.0- Flag- Aktl相比无差异，此实验重复3次，图标注的有统计学意义。同样，West-ern印迹也验证了Aktl( T308A)去磷酸化后，耐药细胞中P-Akt308磷酸化水平下降，Notchl、Hesl蛋白表达也下降；而持续磷酸化时，P-Akt308和Notchl、Hes1蛋r1表达上调，与野生型pcDNA3.O-Flag-Aktl的条带相比灰度兀差异。
2.4 CCK-8法验证磷酸化Aktl (Thr308)位点突变对胃癌顺铂耐药细胞的影响
用上述瞬时转染pcDNA3.0- Flag- Aktl、Aktl( T308A)、AktI(T308E)和空载体已鉴定表达的人胃癌耐药细胞BGC-823/cDDP，通过CCK-8实验，得到耐药细胞生长曲线（图6）。培养12 h时，转染Aktl(T308A)、Aktl( T308E)实验组与空载体和野生型pcDNA3.0- Flag- Aktl，以及用PI3K特异性抑制剂LY294002(20 pdmol/L)处理的对照组之间无明显差异；培养24、48、72、96 h后，转染pc:DNA3.0- Flag-Aktl (T308A)实验组与空载体对照组相比，对耐药细胞生长有明显抑制作用，在不同时段与LY294002处理对照组相比差异无统计学意义；转染pcDNA3.O-Flag-Aktl( T308E)实验组与空载体对照组相比，促进耐药细胞生长，与野生型pcDNA3.0-Flag-Aktl对照组相比差异无统计学意义。此实验重复3次，数据有统计学意义。
3讨论
耐药是胃癌化疗失败的最主要因素之一，因其监测和逆转机制复杂，目前仍不能得到完全解释和有效解决。研究表明，PI3K/Akt作为信号通路网络的中枢环节，在胃癌化疗耐药的机制中扮演着重要角色。Hong等构建Aktl siRNA的真核表达载体，转染人胃癌细胞AGS后明显抑制AGS细胞中Aktl的表达水平，且Bcl-2表达水平显著下降、Bax表达水平上调，同时增强了阿霉素、长春新碱和5-FU等化疗药物的敏感性。Yu等研究发现，PI3K／Akt和MAPK/ERK信号传导通路的激活，导致p53表达下调、c-myc表达增强，从而下调胃癌化疗药物依托泊甙的敏感性。Baba等利用MTT法测定化疗药物在76例胃癌组织中的敏感性时发现p-Akt与多药耐药增加有关。PI3K/Akt/mTOR信号通路与Notchl信号通路的激活关系错综复杂。Notchl通过调控肿瘤干细胞的上皮间充质转化，导致肿瘤耐药。Yeh等研究发现，Notchl在胃癌顺铂耐药细胞中表达上调。同样，在头颈部鳞状细胞癌、卵巢癌、宫颈癌等，Notchl也被证实在顺铂耐药癌症患者的细胞中表达上调。目前，关于PI3K/Akt与Notchl信号通路的激活调控胃癌耐药的机制尚不明确，因此利用点突变方式分别将磷酸化Thr308位点的苏氨酸突变成丙氨酸和谷氨酸，使磷酸化Thr308位点失活和模拟持续磷酸化，可检测磷酸化Aktl及Notchl蛋白的表达变化，并探讨磷酸化Aktl(Thr308)位点突变在胃癌顺铂耐药细胞中的生物学功能。
我们用Western印迹验证了pcDNA3.0- Flag-Aktl (T308A)、Aktl(T308E)位点突变在细胞中的表达，并验证了去磷酸化pcDNA3.0- Flag- Aktl( T308A)下调了耐药细胞BGC- 823/cDDP中p-Akt308磷酸化水平及Notchl、下游Hesl的表达水平，而模拟持续磷酸化pcDNA3.0- Flag- Aktl(T308E)增强了耐药细胞中p-Akt308磷酸化水平及Notchl、下游Hesl的表达。说明抑制或增强p-Akt( Thr308)能阻断或激活耐药细胞中p-Akt和Notchl的信号传递，可以为逆转胃癌顺铂耐药提供新的思路。为研究磷酸化Aktl( Thr308)位点突变在胃癌耐药细胞中的生物学功能，我们采用CCK-8实验检测Aktl( Thr308)位点突变对胃癌顺铂耐药细胞BGC-823/cDDP的影响，发现转染去磷酸化pcDNA3.0-Flag- Aktl (T308A)和使用PI3K特异性抑制剂LY294002处理后抑制胃癌顺铂耐药细胞增殖，当转染模拟持续磷酸化pcDNA3.O-Flag-Aktl(T308E)时促进耐药细胞生长。提示阻断P13 K/Akt和Notchl信号通路能抑制胃癌顺耐药细胞的增殖，而信号通路的激活会下降耐药细胞对化疗药物的敏感性。
综上所述，本实验证实了去磷酸化pcDNA3.0-Flag-Aktl(T308A)（苏氨酸突变成丙氨酸）可以有效下调磷酸化Aktl和Notchl蛋白表达，阻断信号通路，从而抑制胃癌顺耐药细胞的增殖，逆转胃癌顺铂耐药；模拟持续磷酸化pcDNA3.0- Flag- Aktl(T308E)（苏氨酸突变成谷氨酸）使磷酸化Aktl和Notchl表达上调，激活信号通路，介导胃癌耐药，据此推测PI3K/Akt和Notchl信号传导通路在胃癌耐药的发生、发展过程中发挥重要作用。磷酸化Aktl(Thr308)位点突变质粒的构建，为后续研究P13K／Akt和Notchl信号传导通路的激活影响胃癌耐药的发生、发展奠定了基础。
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