药食两用铁皮石斛中水溶性多糖测定方法的优化及验证

  李雨虹1，董文宾1*，付瑜1，樊成2，欧阳凡1

  1．陕西科技大学食品与生物工程学院(西安710021)；2．陕西省产品质量监督检验研究院（西安710048）

摘要水溶性多糖是铁皮石斛植物中重要的组成成分，具有很好的保健功效。为了确定一种特异性、准确性、可重复、灵敏性好的苯酚-硫酸法来定量分析铁皮石斛的多糖含量。试验以D -葡萄糖作为标准单糖，确定490 nm处为检测波长。通过单因素和L9(34)正交试验获得最优反应条件为：温度30℃，6%的苯酚0.3 m L，浓硫酸4.5 m L，保温时间25 min,试剂的添加顺序：苯酚-样品-浓硫酸。校正曲线在8.00～104.00 μg/m L范围内呈线性关系，相关系

数为0.999 8。检出限与定量限估算值分别为1.1μg /m L和3.33μg /mL。样品溶液在显色反应后2h内表现出高稳定性。精密度和回收率分别为3.27%和96.9%,102.5%0。

关键词铁皮石斛；水溶性多糖：苯酚一硫酸法

 铁皮石斛（Dendrobium officinale Kimura et Migo）为兰科石斛属多年生植物，又名黑节草，是一种名贵的中草药。因其具有益胃生津，滋阴清热等作用，有很高的药用价值和保健功效，被誉为“中华九大仙草”之首。铁皮石斛的主要生物活性成分有多糖、生物碱等，其中多糖的含量最多。经药理学研究表明，铁皮石斛多糖具有抗氧化、抗衰老、增强机体免疫力、抗肿瘤等药理活性。因此，准确地鉴定铁皮石斛多糖含量对研究与开发铁皮石斛资源和质量控制具有重要意义。

 目前，测定铁皮石斛多糖含量的主要方法是苯酚-硫酸法和蒽酮-硫酸法。蒽酮-硫酸法测定的是所有碳水化合物的总量，不仅可测出戊糖与己糖，而且还包括寡糖类和多糖类（淀粉、纤维素等），故蒽酮-硫酸法不能准确地测定多糖含量。而苯酚-硫酸法测定的是溶于水及乙醇的单糖和多糖类的总量，根据换算因子最终可得出多糖含量，误差相对较小，故采用苯酚-硫酸法来测定铁皮石斛多糖的含量。经研究表明，铁皮石斛多糖的结构为一类O-乙酰葡萄甘露聚糖类型的多糖，由大量的葡萄糖构成，所以试验采用葡萄糖作为苯酚-硫酸法的标准单糖。

 试验对影响多糖含量测定的5个因素（添加顺序、保温温度、6%苯酚量、浓硫酸量和保温时间）进行单因素试验，并在此基础上进行L9(34)正交试验得出最优反应条件，进一步为研究铁皮石斛资源和质量控制提供理论基础，并对今后开发铁皮石斛多糖类保健食品奠定了基础。

1  材料与方法

1.1仪器与试剂

  722N型可见分光光度计：上海精密科学仪器有限责任公司；RE-52型旋转蒸发仪：上海亚荣生化仪器厂；SHZ-D(Ⅲ)循环水式真空泵：巩义市予华仪器有限责任公司；BS224S型万分之一分析天平：北京赛多利斯仪器系统有限公司；HH-2型电热恒温水浴锅：北京科伟永兴仪器有限公司；H1850型台式高速离心机：湖南湘仪实验室仪器开发有限公司；DZ-1BC真空干燥箱：天津泰斯特仪器有限公司。

 铁皮石斛鲜品：陕西省秦脉生物科技有限公司；D-无水葡萄糖：分析纯，天津市北方天医化学试剂厂；苯酚、浓硫酸、无水乙醇、正丁醇、丙酮、三氯甲烷：分析纯，天津市富宇精细化工有限公司。

1.2材料

1.2.1原材料的准备

 取铁皮石斛鲜品洗净，将其切至约1cm长的小茎段，先105 ℃杀青15 min后60℃烘干至恒重，将干燥后的茎段粉碎至细粉，过60目筛备用。

1.2.2铁皮石斛多糖的提取

 精密称取铁皮石斛干燥细粉2.000 g，置圆底烧瓶中，用体积分数为90%乙醇加热回流2次除去杂质，去上清液。再取残渣加入石油醚50 m L，振荡30 min后静置12 h，除去石油醚。加100 m L水，90℃热水浸提1h，提取2次，将上清液收集浓缩，4倍量体积分数为95%乙醇沉淀数次，再溶解浓缩置于40 m L离心管中。按浓缩液和蛋白质试剂体积比为5:1加Sevage试剂（三氯甲烷与正丁醇体积比5:1），振荡10 min,离心，取上清液，重复上述操作5～6次至脱蛋白完全。将除去蛋白质的浓缩液加4倍量体积分数为95%乙醇沉淀，并将沉淀物依次用无水乙醇、丙酮洗涤，除去溶剂，真空干燥得粗多糖。

1.3铁皮石斛多糖测定方法的优化

 1.3.1最大吸收波长的确定

 精密吸取1 m L的80 μg/m L葡萄糖标准溶液，分别加入一定量的6%苯酚溶液、浓硫酸溶液，立即水浴保温一定时间后，在紫外可见灯扫描进行。选择适当的吸收波长对定量分析的特异性和敏感性很重要。

1.3.2紫外分光光度法测定石斛多糖含量

 称取10 mg的石斛样品用蒸馏水定容至50 m L容量瓶，精密吸取该样品溶液0.5 m L于10 m L具-塞试管中，分别加入一定量的6%苯酚溶液、浓硫酸溶液，立即水浴保温一定时间后，在检测波长处测定吸光度，由标准曲线得出总葡萄糖含量。

  采用上述同样步骤，精密称取精制的铁皮石斛纯多糖10 mg，由吸光度测得该纯化后的总葡萄糖量，按公式(1)计算出换算因子F，并代入公式得出多糖含量。

  F=m/( C x D) (1)

  式中：m------精制的铁皮石斛多糖质量，mg;C------精制的铁皮石斛多糖测得的总葡萄糖质量浓度，μg/m L; D-精制的铁皮石斛多糖的稀释因素。

1.3.3单因素试验

 试验添加铁皮石斛多糖( Sa)，6%苯酚(P)及浓硫酸( Su)，分别对样品添加顺序(Sa PSu,Sa SuP，Su SaP，SuPSa，PSaSu，PSuSa)、保温温度( 20 0C, 30℃.40℃,50℃,60℃和70℃)、6%苯酚量(0.2，0.4，0.6，0.8，1.0，1.2，1.4和1.6m L)、浓硫酸量(3.5，4.0，4.5，5.0，5.5，6.0, 6.5和7.0 m L)、保温时间(5，10，15，20，25，30，35和40 min)影响因素进行研究，固定其他条件，得出单因素试验结果。

1.3.4正交试验的设计

 根据单因素试验的结果，对保温温度、6%苯酚量、浓硫酸量和保温时间进行4因素3水平的L9(34)正交试验，试验设计见表1。

1.3.5标准曲线的制作

 精密称量105℃干燥3h至恒重的葡萄糖标准品20 mg，用蒸馏水定容至250 m L容量瓶中，配置得80 Vg/m L的葡萄糖标准溶液。分别吸取0，0.1，0.3，0.5，0.7，0.9，1.1和1.3 m L的80 μg/m L葡萄糖标准液，采用优化后的多糖测定方法得出吸光度，并绘制标准葡萄糖曲线。

1.3.6方法可行性试验

 ①稳定性试验。精密吸取0.5 m L多糖样品溶液，按样品测定方法，每隔20，40，60，80，100和120 min测定一次吸收度，验证方法的稳定性。

 ②精密度试验。按样品测定方法，吸取葡萄糖标准溶液( 50 μg/m L) 0.5 m L进行精密度试验，连续进行6次，测定其吸光度，验证方法的精密度。

 ③重现性试验。精确吸取6份0.5 m L多糖样品溶液，按样品测定方法，测定其吸光度，验证方法的重现性。

 ④加样回收率试验。精密吸取0.3 m L多糖样品溶液5份，分别加入质量浓度为50μg/m L的标准葡萄糖溶液0.1，0.2，0.3，0.4和0.5 m L，按样品测定方法得吸光度，计算回收率。

2结果与分析

2.1波长的选择

 在360～530 nm处用紫外分光灯扫描的吸光度，结果如图1所示。在波长为490 nm时吸光度达到最大，故采用490 nm为最适波长。

2.2单因素试验

2.2.1样品添加顺序的影响

 固定保温时间：30 min；6%苯酚量：0.5 m L；浓硫酸量：4.0 m L；保温温度：20℃。根据试验步骤，最终确定的添加顺序是铁皮石斛多糖( Sa)，6%苯酚(P)及浓硫酸(Su)。试验研究添加的顺序是：SaPSu，SaSuP，SuSaP，SuPSa，PSaSu和PSuSa。结果如图2所示。结果显示，吸收度按依次减弱的顺序：PSaSu> SaPSu> SaSuP> SuSaP> SuPSa> PSuSa。添加顺序不同的影响因素可能是因为多糖在硫酸的作用水解成单糖迅速脱水生成糖醛衍生物，与苯酚生成橙黄色化合物，先加入苯酚可能使反应更充分，所以试验中按PSaSu顺序添加的吸光度较大。

2.2.2保温温度的影响

 固定添加顺序：PSaSu；6%苯酚量：0.6 m L；保温时间：30 min；浓硫酸量：4.0 m L。如图3所示，温度在20℃～30℃时吸光度增加，之后随着温度的增加吸光度平缓下降。因为在显色体系中，随着温度的升高，能量释放的越多，使更多的液体挥发损失，所以温度不能超过35℃。

2.2.3  6%苯酚量的影响

 固定添加顺序：PSaSu；浓硫酸量：4.0 m L；保温时间：30 min；保温温度：20℃。在490 nm处测得6%苯酚量对吸光度的影响如图4所示。当6%苯酚量在0.2～0.4 m L时，吸光度明显增加。当6%苯酚量>0.4m L时，吸光度急剧下降。原因可能是因为6%苯酚的加入量对显色体系中橙色复合物的形成影响很大。

2.2.4浓硫酸量的影响

 固定添加顺序：PSaSu；6%苯酚量：0.6 m L；保温时间：30 min;保温温度：20℃。浓硫酸的量与显色体系的pH、显色试剂的颜色和吸光度有很大的联系。如图5所示，吸光度在开始时呈上升趋势，然后随着浓硫酸量的增加而降低。当浓硫酸量为5.0 m L时，吸光度最大。

2.2.5保温时间的影响

 固定添加顺序：PSaSu; 6%苯酚量：0.5 m L;浓硫酸量：4.0 m L;保温温度：20℃。在490 nm处不同保温时间的吸光度如图6所示。结果表明，从5～25 min吸光度随着保温时间的增加而增加。吸光度随着保温时间的延长而增加，可能是因为显色反应需要很长时间才能形成橙色复合物。但是，在保温时间超过25 min后，吸光度开始降低，可能是橙色复合物发生了。

2.3正交试验

  根据单因素试验的结果设计L9(34)正交试验来优化显色反应条件，在波长490 nm处进行吸光度测定，所有试验都进行3遍。正交试验的设计及结果如表2所示。

  由表2的结果显示，影响苯酚-硫酸法吸光度的因素主次为：C浓硫酸加入量>A保温温度>D保温时间>B 6%苯酚量，其中浓硫酸的量影响比较显著。所以正交试验结果确定的最优试验搭配为A3B1C1D1，即保温温度30℃，6%苯酚量0.3 m L，浓硫酸量4.5 m L，保温时间25 min。通过与条件A1B1C1D1的验证试验结果看，A3B1C1D1条件下的平均吸光度为0.589，因此为最优。

2.4葡萄糖标准曲线的绘制

  用可见分光光度计在490 nm处测定吸光度，以空白样做参比，以不同质量浓度的葡萄糖作为标准单糖测定的结果见表3。得葡萄糖标准曲线线性回归方程：y=0.006 1x+0.004。r2=0.999 6，相关系数r=0.999 8，表明葡萄糖浓度在8.0～104.0μg/m L范围内呈良好线性

关系。

2.5检出限与定量限

 用校正曲线的斜率和葡萄糖标准溶液吸光度的标准偏差来估算检出限与定量限。检出限与定量限估算值分别为1.1μg/m L和3.33μg/m L。结果表明，多糖浓度在1.1 μg/m L时在杂质噪音和设备中能够明显地检测出噪声信号。浓度在3.3μg/m L时能准确地量化分析多糖的含量水平。

2.6稳定性试验

 为了确定试验具有可重复性及稳定性，在上述确定的最优条件下，对显色反应进行稳定性试验。取样品0.5 m L，连续2h，每隔20 min测定一次吸光度，观察其稳定性，见表4。结果表明在显色120 min内吸光度稳定性较好。

2.7精密度试验

  按样品测定方法，吸取标准溶液（50μg/m L）0.5 m L进行精密度试验，连续进行6次测定吸光度，得RSD=3.27%< 5%．表明精密度好，结果见表5。

2.8重现性试验

 精确吸取来自同一批原料的试样，按样品测定方法，分别测定其吸光度，得RSD=0.005%<5%。表明重复性较好，结果见表6。

2.9  回收率试验

 按照样品测定方法，测得样品中加入葡萄糖溶液的总糖含量，回收率结果见表7，样品回收率均在95%～105%之间，表明此法可行。

3结论

 通过对影响因子进行的单因素试验及L9(34)正交试验得出的最优反应条件是：温度30℃；6%的苯酚0.3m L：浓硫酸4.5 m L；保温时间25 min;试剂的添加顺序：苯酚-样品-浓硫酸。检出限与定量限估算值分别为1.1 μg/m L和3.33μg/m L。样品溶液在显色反应后2h内表现出高稳定性。校正曲线在8.00～104.00 μg/m L范围内呈线性关系，相关系数为0.999 6。结果显示，优化后的苯酚-硫酸法对铁皮石斛多糖的测定具有特异性、准确性、精密度高的特点，为铁皮石斛多糖资源的分析与利用提供了重要依据。