吕智慧1，侯如标1，邱芳萍1,2*
1．长春工业大学化学与生命科学学院（长春130012）；
2．长白山动植物资源开发与利用产业研发中心主任（长春130012）
摘要 北冬虫夏草(CS-4)富含虫草多糖、虫草酸、腺苷类物质等多种生物活性成分，是野生冬虫夏草最佳的替代品，试验建立了一种超声-微波联合提取法，辅助HPLC测定CS-4菌丝体冻干粉中腺苷类活性成分。结果表明：用料液比1：300 (g/m L)的蒸馏水超声提取15 min, 440 w微波提取6min,腺苷类物质的提取率高达61.24%。经HPLC检测，对菌丝体冻干粉中5种生物活性成分（胞苷、尿嘧啶、尿苷、腺苷和虫草素）进行了定性定量分析，含量分别为92.54 μg/g,305.79μg /g,1.79 mg/g,785.85 μg/g和695.64 μg/g.
关键词超声-微波联合提取法：HPLC;菌丝体；腺苷类物质
野生冬虫夏草是中国传统的名贵滋补品，因其资源有限，且产量逐年下降，已无法满足市场需求。从野生冬虫夏草真菌中分离，经人工培养二级扩培，经液体深层发酵得到的CS-4是野生冬虫夏草极佳的替代品。据研究报道，CS-4中的有效成分、生物活性与药理药效与野生冬虫夏草极为相似，即腺苷类物质，具有抗肿瘤、抗菌、抗氧化、抗炎等作用。
目前腺苷类物质的提取方法主要有：热回流提取法、超声波提取法、基质固相分散法、
微波辅助提取法和超临界萃取法等。试验在综合、比较、改进现有提取方法的基础上，采用超声一微波联合提取法提取腺苷类物质，该方法与传统方法相比，具有反应时间短、操作简单，提取率高等优点，适用于规模化发酵北冬虫夏工艺中。该方法辅助HPLC法检测腺苷类物质，经梯度洗脱，能较好的分离腺苷类物质。
1 材料与方法
1.1材料
原料：CS-4菌丝体冻干粉：吉林省长白山动植物资源开发与利用产业公共技术研发中心提供。
试剂：虫草素、腺苷、尿嘧啶、胞苷、尿苷：美国Sigma公司；乙醇、甲醇、丙酮、四氢呋喃、乙酸乙酯、冰醋酸：分析纯；甲醇：色谱纯。
1.2仪器与设备
超声波细胞粉碎仪：巩义市英峪予华仪器厂；TD25-WS离心机：湖南赛特湘离心机仪器有限公司；RE52-98旋转蒸发器：上海亚荣生化仪器厂；752紫外-可见分光光度计：上海精密科学仪器有限公司；FD-1C冷冻干燥机：北京德天佑科技发展有限公司；RPL-D2000 COLMMN HBATER高效液相色谱仪：山东鲁南瑞虹化工仪器有限公司；MM823EC8-PS(X)型美的微波炉：广东美的生活电器制造有限公司。
1.3储备液和样品溶液的制备
1.3.1标准品储备液的制备
将腺苷、虫草素、尿嘧啶、胞苷和尿苷标准品分别用90%甲醇溶解，配制浓度为1 000μg /m L的储备液，和5种标品的混合储备液。
1.3.2样品溶液的制备
准确称取2.0 g虫草菌丝体冻干粉于250 m L三角瓶，加200 m L蒸馏水，超声波提取15 min，微波提取6min，离心，上清液浓缩到100 m L，加200 m L 95%乙醇静置1d，再离心，上清液浓缩后冻干，准确称取冻干粉0.005 0 g，用90%的甲醇溶液溶解并定容到10 m L
用于检测。
1.4检测方法
1.4.1 紫外分光光度法测定腺苷类物质
取腺苷标准品储备液，用蒸馏水稀释，配制浓度为5，10，25，35和40μg/m L的腺苷标准溶液，于260nm处检测各吸光度），重复3次取平均值，并计算腺苷类物质的提取率。
1.4.2高效液相色谱法测定腺苷类物质
色谱条件：色谱柱：Kromasil C18柱(4.6 mm×250mm，5μm)，流动相为pH 3.8的醋酸水溶液(A) -甲醇(B)，流速：0.5 m L/min，检测波长260 nm，进样量10 μL，温度25℃。梯度洗脱条件见表1。
1.5响应面优化试验
根据单因素试验结果，利用Design Expert 7.0.0Box-Behnken中心组合试验设计响应面。以超声时间(A)、微波时间(B)、微波功率(C)，料液比(D)为自变量，腺苷类物质提取率(Y)为响应值。响应面试验因素水平编码见表2。
2结果与分析
2.1腺苷标准曲线的绘制
根据检测方法1.5.1检测，结果见图1。以腺苷浓度为横坐标，吸光度为纵坐标，得到回归方程为，y=51.061x+0.050 8，R2=0.999 7。
2.2单因素试验结果
2.2.1 超声时间对提取率的影响
由图2可知随着超声时间的增加，提取率逐渐增大，当超声20 min时，提取率达到最大值，继续增加超声时间对提取率的影响不显著，所以选择超声时间为20 min。
2.2.2微波时间对提取率的影响
由图3可以看出，随着微波时间的增加，提取率逐渐增加，微波6 min时提取率达到最大值，再延长微波时间提取率出现了下降趋势，这是因为随着微波时间的延长提取剂的温度升高，造成溶剂蒸发，提取不彻底。因此最佳微波时间为6 min。
2.2.3微波功率对提取率的影响
由图4可知提取率随微波功率的提高呈先增加后降低趋势，440 W时提取率达到最大值。因为微波功率越高，相同时间内提取剂温度升的越高，高温容易破坏腺苷类物质，使提取率降低，所以选微波功率为440 W。
2.2.4料液比对提取率的影响
由图5看出，随着提取率的增加，提取率逐渐增大，当料液比达到1：200( g/m L)时，提取率达到最大值，继续增加料液比提取率逐渐降低，所以选择料液比为1：200( g/m L)。
2.3响应面优化试验结果
2.3.1 响应面试验设计及结果分析
响应面试验设计及结果见表3。由表3可以看出共有29个试验点的响应面分析试验，其中24个析因试验，5个中心试验，零点区域重复5次。
2.3.2响应面
经二次回归分析，得到CS-4菌丝体冻干粉中腺苷类物质的提取率y对超声时间A、微波时间B、微波功率C和料液比D拟合的二次回归方程为Y=60.04 - 0.27A+1.50B+1.77C+2.27D-0.1 8AB+0.32AC+0.46AD+1.09BC-0.21BD-0.14CD-3.86A2-
4.48B2-3.02C2-1.02D2。
对回归模型做方差分析，结果见表4。由表4可以看出，方程一次项C、D和二次项A2、B2、C2对提取率的影响极显著，交互项作用对提取率的影响不显著。由F值大小可以看出各因素对腺苷类物质提取率影响的顺序为：D>C>B>A；二次多项模型极显著(p模型<0.001），失拟项p<0.000 1，所以该模型拟合度好，回归模型相关系数R2较高，说明回归模型与实际值的拟合程度较好，综合上述参数，表明该方法可靠，因素水品设计合理，回归模型可以用来分析试验结果。
2.3.3 响应面图分析
由图6可知，腺苷类物质的提取率随着超声时间(A)、微波时间(B)、微波功率(C)的增加，呈现先增加后降低趋势，随着料液比(D)的增加提取率逐渐增加。
利用Design Expert 7.0.0 Box-Behnken软件优化得到的最优工艺为超声时间15.16 min，微波时间6.36min，微波功率493.12 W，料液比1：300( g/m L)，在此条件下模型预测的最大提取率为61.65%。根据实际操作调整工艺，最终最优工艺为超声时间15 min，微波时间6 min，微波功率440 W，料液比1：300(g／m L)。按照调整工艺做3次平行试验，得到的CS-4菌丝体冻干粉中腺苷类物质的提取率为61.24%，与预测值的相对误差为0.92%，说明响应面优化的提取工艺可行。
2.4 HPLC检测结果
2.4.1各标准品标准曲线的绘制
分别吸取各标准品的系列标准溶液10 μL用于HPLC检测，测定峰面积，并以标准品浓度为横坐标，峰面积为纵坐标，绘制标准曲线，得到回归方程。结果见表5。
2.4.2混合标准品和样品的HPLC图谱分析
按1.4.3处理得到样品溶液，过0.45μm 滤膜，分别吸取标准品混合储备液和样品溶液10μg=L，用于HPLC检测，检测结果如图8。
由图8可知胞苷、尿嘧啶、尿苷、腺苷和虫草素的保留时间为依次为4.085，6.573，9.810，21.565和22.983 min，与标准品（见图7）的保留时间基本一致，证明CS-4菌丝体中含有中存在上述腺苷类物质，通过回归方程计算，含量分别为92.54μg/g，305.79μg/g,1.79 mg/g,785.85μg /g和695.64μg/g。
3结论
试验比较了多种提取方法：热回流提取法、超声波提取法、超声波-微波联合提取法、涡旋提取法和热搅拌提取法，试用了多种提取剂：蒸馏水、甲醇、丙酮、四氢呋喃、乙酸乙酯，结果表明以蒸馏水作为提取剂，1：300( g/m L)混合CS-4菌丝体冻干粉，超声提取15 min，440 W微波提取6 min，腺苷类物质的提取率高达61.24%。此外，试验确定了一种可用于检测CS-4菌丝体冻干粉中腺苷类物质的高效液相色谱法，经检测发现1g菌丝体冻干粉中，胞苷、尿嘧啶、尿苷、腺苷和虫草素的含量分别为92.54 μg/g，305.79μg/g，1.79 mg/g，785.85μg/g和695.64 μg/g。该方法用pH 3.8的醋酸水溶液-甲醇梯度洗脱，较好的分离了5种腺苷类物质，分离度高，时间短，杂质干扰小，可用于CS-4和富含CS-4的保健品等相关产品中腺苷类物质的定量定性分析，可为CS-4系列产品的品质评价体系的建立提供理论和实践参考。
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