黄正虹
贵州中烟工业有限责任公司(贵阳550001)
摘要以一定比例的丙酮溶液为提取溶剂，以乌饭树叶多酚的得率为指标，对超声波萃取乌饭树叶多酚的工艺进行考察，并对所得乌饭树叶多酚进行了卷烟加香试验。以丙酮溶液体积分数、超声功率、固液比、超声温度和超声时间为考察因素，采用单因素和响应面分析试验法同时对乌饭树叶多酚提取工艺进行优化。试验结果确定了采用体积分数为40%,的丙酮溶液提取效果最佳，从而得到了40%丙酮提取一超声波萃取的最佳工艺参数为：超声功率116 W、40%丙酮固液比1：63 (g/m L)、超声温度75℃和超声时间15 min。超声波萃取乌饭树叶多酚的最佳得率为2.11%。乌饭树叶多酚卷烟加香应用结果表明，乌饭树叶多酚能掩盖杂气，改善余味，降低刺激感。
关键词超声波萃取；乌饭树叶多酚；响应面分析优化
乌饭树树叶(Vaccinium bracteatum Thunb.leaves．VBTL)为我国南方传统药食同源的植物资源，其中富含多酚、多糖、花色苷类、多酚类和单宁类等多种具有一定生物活性有效成分，其提取物具有抑菌、抗氧化、抗癌防癌和抗疲劳等生理功效。
乌饭树多酚的提取方法主要有水提法、酶提法等，但是一直未得到很好解决多酚提取效率低下及产品得率不高的问题。超声波技术是目前提取领域较为成熟的一项技术，在多种生物活性成分物质的高效提取方面都得到了较为完善的应用，其原理主要是利用低频激烈的振荡产生的强烈空穴效应、自由基效应、热力学和非热力学等多重效应来达到其对材料作用的目的。
试验正是基于超声波提取的优点，将其应用于乌饭树多酚的提取工艺研究，通过优化工艺，高效提取乌饭树多酚，并对乌饭树多酚在卷烟应用效果进行研究，以期为乌饭树多酚在卷烟中的应用提供理论和数据支持。
1 材料与方法
1.1试验材料
1.1.1乌饭树叶样品
试验用乌饭树叶为云南红河哈尼族彝族自治州绿春县产。称取一定量的乌饭树叶样品于已烘干至恒重的称量皿中，置于60℃烘箱中烘至近干，然后将烘箱温度调至105℃烘至绝干，并过80目筛，备用。
1.1.2试验试剂
无水NaCO3、无水丙酮、Folin-Ciocalteu试剂等试剂，均为分析纯：国药集团化学试剂有限公司；超纯水，Millipore Mill-Q超纯水系统自制。
1.2试验仪器与设备
KQ-250DE型台式数控超声波清洗器：昆山市超声仪器有限公司；数显恒温水浴锅HH-2:江苏金坛市荣华仪器制造有限公司；紫外可见分光光度计WFZ UV-2100型：尤尼柯公司；电热恒温鼓风干燥箱DHG-9140A型：上海精宏实验设备有限公司；B agMixer均质器：法国Interscience公司；数显303AS-3电热培养箱：上海浦东荣丰科学仪器有限公；BD-240电热恒温培养箱：德国宾得公司；低温冷冻离心机J26XPI型：Backman公司；旋转蒸发器RV05Basic型：IKA公司；CPA124S型电子分析天平：德国Sartorius公司；DELTA 320pH计：梅特勒一托利多仪器（上海）有限公司；Biocel型Millipore Mill-Q超纯水系统：美国Millipore公司。
1.3试验方法
1.3.1提取方法
取乌饭树叶颗粒粉碎、过筛，分别精密称取150.0mg样品，根据Box-Behnken试验设计中心组合试验设计原理，设计分别进行提取（超声波处理）。过滤所得提取液，清洗残渣，合并洗液及滤液，浓缩，干燥，作为乌饭树叶多酚样品。采用4因素3水平的四元二次响应面分析方法，自变量的试验水平分别以-2、-1、0、1、2进行编码（表1），共设计30个试
验点，其中24个为析因点，6个为零点试验用以估计试验误差。
采用最小二乘法拟合二次多项方程表达响应值：
式中：Y-响应值（乌饭树叶多酚得率）；A
编码值。采用统计学的F直、p值及方差分析检验模型方程多项式各系数的拟合和回归。
1.3.2单因素考察
对预处理后的乌饭树叶颗粒，考察丙酮溶液体积分数、超声功率、固液比、超声温度和超声时间5个因素对多酚得率的影响。
1.3.3标准曲线的制备及乌饭树叶多酚含量的测定
1.3.3.1标准曲线的制备
分别取100，200，400，600，800和1000 μL的0.200 mg/m L的没食子酸标准溶液，定容致1000μL。然后依次加入Folin-Ciocalteu显色剂1 m L、10%碳酸钠溶液2 m L，25℃反应1 h。用分光光度计测定在763 nm处吸光度。以吸光度为纵坐标，以没食子酸的质量浓度( mg/m L)为横坐标，建立回归方程为：
Y=0.034X-0.024( R2=0.999 4).
式中：Y------吸光度；X-------没食子酸质量浓度，mg/m L。
1.3.3.2乌饭树叶多酚含量测定
取乌饭树叶多酚提取液1 m L，按照回归方程的方法测定，根据回归方程计算得出乌饭树叶多酚含量。
乌饭树叶多酚得率=乌饭树叶多酚质量(g)／所用的干燥的乌饭树叶颗粒质量(g) x100% (2)
1.3.4加香试验
分别称取乌饭树叶多酚0.005，0.025和0.05 g，加入10 g蒸馏水，混匀后，用微量喷雾器均匀地喷于50g烟丝上，放人温度22℃±1℃，相对湿度60%±2%的恒湿箱内平衡24 h，卷制成烟支，由评吸专家小组进行评吸。空白组只加入等量蒸馏水。
2结果与讨论
2.1提取溶剂的选择
丙酮为植物多酚的常用提取溶剂，当样品为固体时，纯的有机溶剂不足以破坏样品中多酚类物质与蛋白质或其它物质的连接，多酚的得率低，但当提取剂中水的比例过高时，糖类等水溶性杂质的浸出率也较高。不同极性溶剂对多酚物质的提取效果有显著的影响，如图1所示，水和纯溶剂提取乌饭树叶多酚时提取量都比较低，丙酮体积分数在40%时多酚提取量较高。因此后期在进行超声波萃取试验优化是，选择体积分数为40%的丙酮溶液作为乌饭树叶多酚的最适提取溶剂。
2.2超声波功率对乌饭树叶多酚得率的影响
固定固液比1：70( g/m L)、超声温度75℃和超声时间20 min，考察不同超声波功率(50，70，90，1 10，130, 150和170 W)对乌饭树叶多酚得率的影响，结果如图2所示。由图2可知，在50～130 W范围内，随着超声波功率增大，多酚得率明显增加，原因可能是随着超声功率的增加，超声波所产生的空穴造成细胞结构的局部塌陷，使多酚大量溶出。继续增大
超声波功率，得率没有增加，说明功率过大引起局部溶液瞬时升温，过热造成部分多酚分子链的断裂而降解。因此，试验选择130 W为最佳超声波功率。
2.3 40%丙酮固液比对乌饭树叶多酚得率的影响
固定超声功率130 W、超声温度75℃和超声时间20 min，考察不同乌饭树叶颗粒40%丙酮固液比(1：20,1:30,1:40,1:50,1:60,1:70,1:80和1：90( g/m L))对乌饭树叶多酚得率的影响，结果如图3所示。研究发现，40%丙酮固液比在1：20～1：70( g/m L)的范围内，随着提取液水量的增加，得率显著提高；这表明超声波将坚硬的细胞壁有效破碎，在溶出有效成分的同时，溶出一些其他液质，而增加溶剂的比例，可有效降低溶液的黏度，有利于多酚分子的传质扩散。但是，40%丙酮固液比达到1：70(g/m L)时，得率不再增加，反而有所降低；这主要由于在溶剂量达到一定程度之后，多酚类物质已经基本完全溶出，所以得率的变化不再明显。考虑后期处理的成本因素，选择40%丙酮固液比最佳值为1：70(g/m L)。
2.4萃取温度对乌饭树叶多酚得率的影响
固定超声功率130 W、固液比1：70( g/m L)和超声时间20 min，考察不同超声温度(50℃, 55℃, 60℃,65℃,70 ℃,75℃．80℃．85℃和90℃)对乌饭树叶多酚得率的影响，结果如图4所示。可以发现，多酚得率随着温度的升高而增大，当温度达到75℃时多酚得率最大，之后随着温度继续增高得率反而减少；可能是由于植物多酚不易溶于低温的水；而温度过高产生的挥发作用使得液固比降低，乌饭树叶多酚得率开始下降；另一方面，过高的温度有可能使乌饭树叶多酚物质的结构遭受到一定程度的破坏，从而使得多酚得率有所下降。
2.5萃取时间对乌饭树叶多酚得率的影响
固定超声功率130 W、固液比1：70( g/m L)和超声温度75℃，考察不同提取时间(5，10，15, 20,25，30，35，40，45和50 min)对乌饭树叶多酚得率的影响，结果如图5所示。由图5可知，提取时间对多酚得率具有显著性的影响。在5～20 min范围内，随着提取时间的延长，多酚提取得率明显增加；说明超声波能在较短时间内破碎细胞，使位于细胞间和细胞壁的多酚释放出来。当超声提取时间超过30 min后，多酚得率反而略有下降。其原因可能是随着处理时间延长，超声波对植物组织细胞的破壁作用进一步加强，乌饭树叶颗粒组织细胞内大量不溶物及黏性物质等混入提取液中，使溶液中杂质增多，黏度增大，从而增大了传质阻力，影响了多酚成分的溶出；另一方面可能是随着超声提取时间的延长，超声波所产生的空穴造成细胞结构的局部塌陷，部分多酚在醇沉处理过程中损失掉，从而降低了多酚的得率。由此可确定多酚的超声提取时间在20 min为佳。
2.6工艺响应面分析优化
根据单因素试验结果，以X1超声功率、X2固液比、X3超声温度和X4超声时间为因素，进行4因素5水平的响应面分析试验，试验结果见表2。X1X2、X2X4交互项响应面如图6和7所示。
方差分析见表3。从表3可看出，乌饭树叶多酚得率回归方程的失拟项检验及显著性检验都显著；从回归方程各项方差检验可看出，方程的一次项及二次项显著性参差不齐；交互项X1X2和X2X4显著。
以X1超声功率、X2固液比、X3超声温度和X4超声时间为因素，拟合的二次多项式回归方程系数如表4所示。该拟合方程拟合效果显著，可以用于最佳提取工艺条件的拟合及计算。整理得到最佳工艺参数：X1=0.29，X2=0.25，X3=0.90，X4=-0.06。将得到的参数与实际的可调控的试验条件进行比对，得到乌饭树叶多酚的最佳条件为：超声功率116 W、40%丙酮固液比1：63( g/m L)、超声温度75℃和超声时间15min。在此条件下得到最高的理论得率为2.08%。
为检验响应面分析法的可靠性，采用上述最优提取条件进行乌饭树叶多酚的提取试验，实际测得乌饭树叶多酚得率为2.11%，理论预测值与实测值相近，说明该模型可以较好地反映乌饭树叶多酚提取的条件，因此，采用响应面分析法优化得到的提取条件参数可信，具有可行性和参考应用价值。
2.7卷烟加香效果
乌饭树叶多酚在卷烟中的加香试验评析结果见表5。由表5可知，红景天多酚能掩盖杂气，改善余味，降低烟气对喉部的刺激性。乌饭树叶多酚添加量以0.01%～0.05%为宜。
3结论
采用超声功率116 W、40%丙酮固液比1：63(g／m L)、超声温度75℃和超声时间15 min的最佳工艺条件进行试验，得到超声波萃取乌饭树叶多酚的最佳得率为2.11%。超声波技术应用于乌饭树叶颗粒的细胞破壁，可加快多酚的溶出速度，从而更为有效地提高回收率，为乌饭树叶多酚的高效提取和应用提供了可靠环保的工业前景。
感官评吸结果表明，乌饭树叶多酚能掩盖杂气，改善余味，降低刺激感。
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