凌云 陈姗 石文宣 周志刚
（上海海洋大学水产与生命学院，上海201306）
摘要：鉴于采用废水进行微藻培养并生产生物柴油可以有效节省微藻培养成本，甚至会带来额外的经济收益，该研究选取了白行筛选分离的产油微藻斜生栅藻（Scenedesmus obliquus）和四尾栅藻（Scenedesmus quadricauda），对其在上海市4家城市污水处理厂进出水共7个水样中的生长性能和氮磷利用率进行了检测。结果显示，批式培养试验中2种栅藻能较好地适应其巾6个水样并保持正常生长状态，且优势度均在98%以上。6d内微藻对氨氮、总氮和总磷的去除率分别为96%~100%、81%~96%、76%~99%，显示出较好的氮磷利用能力。但在对数生长期内2种微藻均不积累油脂，实际运行中需要另加油脂积累环节。半连续式培养研究结果表明，在每2d换水1次，每次200 mL的换水周期中，南汇城市污水厂的进水能使四尾栅藻及斜生栅藻的生长速度基本稳定在0.20和0.28 g/(L-d)左右，藻种优势度保持在90%左右。研究结果显示，在合适的培养条件下，利用未处理污水培养产油藻以连续运行是可行的，但污水培养的关键问题将是在水力停留时间和微藻停留时间之间找到合适的平衡点，而经济有效的微藻采收回流手段及优势藻种控制技术将是今后的研究重点。
关键词：生活废水；微藻；中性脂；生物质；氮磷利用
随着我国城市化进程的纵深发展，城市生活废水的排放量也随之提高。如上海市2010年的生活废水排放量已达到21.16亿t。以氮、磷含量分别为40—60 mg/L、2～4 mg/L来计算，这些废水中的氮、磷含量已相当于上海市全年氮、磷化肥的施用总量。可见，生活废水中存在着像氮、磷等可被农作物、藻类等利用的宝贵资源。
由于废水成分复杂，特别是重金属元素的存在，使得传统的废水灌溉农作物等再利用技术已不再被人们所接受。利用微生物通过硝化、反硝化作用处理废水的传统方法将废水中的氮转化为氮气排放，而磷积累于剩余的污泥中，且大量的剩余污泥又是一个处理难题，使得废水中的氮、磷资源被白白浪费。那么如何更安全地利用废水中的氮、磷资源？
随着石油资源的逐渐枯竭，以微藻为石油替代品的研究与开发正成为目前的热点。但高成本的微藻培养是阻碍其能源化进程的一个“瓶颈”。如果能利用废水培养微藻以获得生产生物柴油的原料，不仅可以回收生活废水中的氮、磷资源，而且可以用废水处理的收益来补贴微藻生物柴油的生产费用，大大降低微藻生物柴油的成本，达到其工业化运行的目的。Lundquist等通过计算发现，如果采用城市生活废水作为微藻营养来源，在较好的设计、运行条件下，算上处理污水带来的收益，微藻柴油成本甚至可以低至28美元／桶，远低于现在油价。
但传统的微藻废水处理应用并未与资源化过程相结合，而现有的微藻生物柴油与废水处理相结合的研究仅限于实验室短批次的培养，藻种对废水的适应性及开放式培养条件下微藻优势度的变化都成为限制该项研究的关键因素，寻找能适应污水的产油微藻及适合培养微藻的废水是一个亟待解决的问题。
由于城市生活污水具有流量大且稳定，水质变化较小，毒性物质含量低等特点，较适合于大规模的微藻培养。为此，本研究选用自上海市一奶牛场废水中筛选到的生长速度较快、含油量较高的斜生栅藻(Scenedesmus obliquus)和四尾栅藻(S. quadricauda)为材料，比较分析了它们在采自上海4家具有代表性的城市生活废水处理厂生化池进、出水口共7个废水水样中的生长性能、抗污能力、对废水中氮和磷的利用情况以及藻细胞中性脂的变化情况，再依据批式试验结果开展30 d的半连续式培养来探讨微藻在光生物反应器中对污水的耐受性和连续运行的可行性，为后续室外利用生活废水规模化培养能源微藻的研究与技术开发提供理论基础。
1材料与方法
1.1废水来源及收集
本试验所用废水采自上海金山、浦东滨海、竹园及浦东临港新城等4个城市生活污水处理厂的曝气池进水口和二沉池出水口（文中简写为进水与出水），对曝气池进水的处理效果试验主要用于检验微藻对污水原水的适应性和氮磷利用能力，而对二沉池出水的处理效果研究将主要用于检验微藻的中水回用能力。
4座污水厂中，竹园1期日处理量近170万t，是上海市最大的城市生活污水厂之一，流量和水质波动最小；金山污水厂处于上海金山化工园区，其处理污水中有50%以上为工业废水，具有服务于工业区的城市污水厂特征；浦东惠南污水处理厂位于上海市郊原南汇区域，包含了周边的农业废水、工业废水及生活污水，与普通中小城市生活污水厂水质相似。而临港新城污水厂处于上海临港开发区，由于周边工商业较少，废水中氮磷含量较低，属于较为低营养型废水，具有新开发区的水质特征。废水在采样后尽量在8h内直接使用，无法用完的废水在冰箱内-20℃冷冻保存。使用时不经任何预处理，以观察其对微藻的影响。
1.2产油微藻的来源
2种产油微藻均为本实验室前期自行分离鉴定，主要选取生长速率较快、含油量较高的斜生栅藻和四尾栅藻，具体见参考文献[13]。
1.3培养装置的选择及样品采集
采用简易的垂直式光生物反应器培养装置，玻璃管直径4 cm，高60 cm，每管装培养基700 mL，为使藻体受光均匀及避免藻体沉降，从顶部接入充气管充气。将玻璃管放人光照培养箱中，温度26℃，光照时间24 h，光照强度80umol photon/(m2.s)。
接种前取对数生长期微藻，参照前期洗脱试验结果，用蒸馏水反复离心洗涤3次以去除微藻可能吸附的氮磷等。
批式培养试验持续6d，调节起始吸光度OD锄值为( 1.000+0.100)．每个废水样品接种2根培养管为平行样。根据预实验结果，每24 h采样测ODc∞值，在0、24、48、72及144 h采样测废水中的氮磷含量，在0、72、144 h采样测定油脂含量。
半连续式培养试验中，采用南汇污水厂的进出水，每管装废水500 mL，根据预实验结果，每48 h取出200 mL混合液，并补入200 mL相应的废水。每24 h采样3 mL测定微藻生长量，采样前后均用纯水补足至500 mL以避免水蒸发导致的误差。
1.4废水及培养液的水质理化指标检测
氮磷指标主要包括氨氮、总氮和磷酸盐，氨氮采用纳氏比色法，总氮采用紫外分光光度法，磷酸盐采用磷钼蓝比色法。具体测试方法依照《水和废水监测分析方法》。
1.5微藻生长量测定
根据预实验结果，2种微藻的质量与吸光度在一定范围内成线性关系，因此微藻生物量(Y，g/L)可利用测定的吸光度OD∞0值，并按以下公式换算成质量：四尾栅藻：Y=0.653 7xOD680-0.045 5；斜生栅藻:Y．614xOD60-0.042 7。吸光度线性范围：0.2<OD680<1.5。
1.6微藻优势度分析
微藻优势度分析：采用显微镜镜检计数，每个样品数10个视野，统计目标藻种的个体数和所有藻种的个体数，优势度=目标藻数量／微藻总数量xl00%。
1.7微藻油脂测定
微藻含油率指标测定采用尼罗红荧光光度法f161，具体操作方法如下：采集4 mL培养液，4 000 r/min离心10 min收集藻体，用5%=甲基亚砜稀释至OD6a;0在1.0左右，取4 mL，微波消解5 min，加入5%尼罗红染液10uL，混匀静止1 min后在荧光分光光度计上测定荧光值Mi，激发波长475 nm，发射波长550nm。每次均用中性脂含量12%的藻粉0.002 g（M2）
为基准计算相对发光强度。计算公式：相对发光强度=Ml/M2 xl00%。
2结果与分析
2.1废水基本指标检测
从4座废水处理厂废水的基本数据（表1）可以看出，废水中的氮主要以氨的形式存在，临港污水厂的氮磷值相对较低，其他3个污水厂的氮磷值相差不大，但竹园的氮磷含量相对稳定。栅藻是污水中的主要藻种，小球藻在金山和临港的出水中较多，舟形藻和颤藻偶有出现，在试验中这几种藻类将成为主要的污染藻种。其余检出藻种包括鼓藻、小环藻、卵囊藻、直链藻、斑条藻、平裂藻、针杆藻等等，但试验中并未成为竞争藻种故不再列出。
2.2微藻在不同来源的废水中生长性能
从2种栅藻在不同来源生活污水的生长曲线（图1）中可以看出：斜生栅藻较适应BG11的营养条件，在144 h后可以达到6.5 g/L，平均生长速率在l g/(L-d)；而四尾栅藻的生长稍慢，在144 h浓度为4.5 g/L，平均生长速率在0.6 g/(L -d)。与BG11培养基（图1）的藻微生长情况相比较，4处城市生活污水厂的污水营养元素都只能维持微藻2—3 d的快速生长；之后微藻生长曲线趋于平缓，生长速率明显下降；6d后，单位体积的微藻生物量大多保持在2—2.5 g/L之间。此外还发现，金山的进水具有一定的抑制性，四尾栅藻在其进水中的生长率低于出水生长率，而斜生栅藻在其进水中的生长曲线更是不升反降，直至第4天开始才开始恢复生长（图1）。
当以0.5 g/L的接种量接种并在废水中培养6d后，培养液中2种栅藻优势度的分析结果（表2）显示，2种微藻均能在废水培养环境中保持98%以上的优势度，说明这2种栅藻具有较好的抗污染性能。偶见小球藻、颤藻等废水土著种，但未呈现爆发态势。当然这部分得益于目标藻种接种量远大于废水中土著藻类生物量（图1）。
2.3 2种栅藻对废水中氨态氮的利用效果
污水中的高氨态氮含量被认为会阻碍微藻的生长，但同时也是微藻最优先利用的氮元素，因此氨态氮的变化可以较好地反映出微藻的适应性。从氨态氮的利用曲线（图2）可以估算出，24 h内，2种栅藻对氨态氮的利用率在20 mg/(L．d)以上。氨态氮起始值较低的竹园和临港污水厂水样在24 h内就降到l mg/L以下；除金山进水外，其余样品的氨态氮均在72 h内降到1 mg/L以下（图2）。该结果与Samori等的报道较为相似。由于在此期间系统的pH值处于中性，变化不大，系统中并未存在能促使氨氮挥发的因素，由于干藻粉含氮量在5%~8%之间，可以认为氨态氮基本都被微藻利用。
2.4 2种栅藻对废水中总氮的利用效果
2种栅藻对总氮利用效果见图3。四尾栅藻和斜生栅藻在24 h内对总氮的利用率最低为56%( NHIN)和46%(NHEF)，最高可达87%(LGIN)和89%( LGEF)；72 h时，四尾栅藻和斜生栅藻对总氮利用率最低为82%(JSIN)和70%(JSIN)，最高达98%( LGEF)和97%( ZYIN)（图3）。由于生活污水中的氨态氮占总氮的80%以上（表1），因此随着氨态氮被微藻的有效利用（图2），总氮也显示出很高的利用率。但由于废水中如偶氮染料等有机氮类等不能完全被微藻利用，因此系统中的总氮并不像氨态氮那样直降到检测线以下，而是在一个较低的水平上浮动。结合总氮利用率及微藻生长量来判断，72 h以后这2种微藻的生长已进入一个缺氮的培养状态。
2.5 2种栅藻对废水中磷酸盐的利用效果
2种栅藻对磷酸盐利用效果见图4，磷同样是微藻的重要营养元素，也是生活污水中主要的污染物质，而微藻主要利用污水中的磷酸盐。从研究中可以看出，除了金山进出水外，其余各组污水中的磷酸盐在24 h左右降解率就已达90%以上，这说明2种栅藻对磷酸盐的利用率较高，且进水中磷酸盐浓度普遍在2 mg/L以下，出水更低，因此在微藻生长条件良好的情况下磷酸盐被很快吸收。
2.6微藻含油量的变化
对含油量的数据分析发现，2种产油藻在对数生长期中性脂含量很低，不到其最高含量的5%，在营养缺乏的时候才开始慢慢积累油脂，批式试验中最高油脂相对含量也仅为20%，而且受到水体、水质的影响较大（图5）。
2.7半连续式培养条件下的微藻生物量变化
在实际运行中，连续式培养是最为有利的培养方式，但由于受到污水的成分复杂及微藻的生长速度限制，连续式的单藻种污水培养并未见报道，即使是实验室中的半连续式培养研究也不多见，如Ruiz Marin等在半连续式的运行过程中曾尝试36 h换水1次，但最终只持续换水4次，微藻就因为营养原因无法继续生长而被迫中止试验。为了进一步研究2种栅藻对污水的耐受性及在污水中的生长性能，我们亦尝试开展污水的半连续式培养试验。竹园的废水由于供应不稳定未开展试验；金山废水由于有生物毒性导致微藻在半连续换水试验中被很快抑制并发生了种群更替，导致试验中断；临港废水由于氮磷含量偏低，换水周期和微藻的生长率之间难以保持平衡；因此主要采用南汇废水进行了试验。半连续培养试验的生物量变化见图6，优势度变化见表3。
图6为连续运行条件下的微藻生长量，可以看出，在半连续式培养条件下，换水量保持在每2d换水1次，每次200 mL，在南汇的进出水中，四尾栅藻的平均生长速率在0.20 g/(L．d)，斜生栅藻的平均生长速率在0.28 g/(L-d)，都要低于批式试验中的生长速率，但相比与类似研究处于中等水平，而出水由于氮磷含量偏低，2d的换水周期太长导致培养液无法支持微藻的快速生长，四尾栅藻与斜生栅藻的生长速率仅为0.02和0.07 g/(L-d)，不到其最大生长速率的1/10。
从表3可以看出，南汇污水的进出水组栅藻优势度都比较高，特别是进水组优势度均在90%上下，出水组也在80%左右。且斜生栅藻的优势度都要高于四尾栅藻，其对污水系统的适应性更好。
3讨论
采用城市生活污水培养微藻，首要的一个问题是微藻对污水营养物质的适应和利用能力。在批式试验中，除金山废水外，2种微藻在前2d的生长率都比较稳定，且进水与出水的培养曲线仅显示出轻微的差别，但结合半连续式试验的结果可以看出进水与出水营养成分的差别导致微藻生长速率差别明显，分析是因为2种微藻的藻体中均有贮存的氮磷，可以支撑其短时间的生长所致。也有文献探讨实验前对微藻进行饥饿培养处理，但在一般运行中微藻并不会处于饥饿状态，而且饥饿状态下的微藻会发生超补偿现象，导致批式试验中废水氮磷迅速下降，实验结果失真。在半连续试验中，临港进出水同样由于低氮磷含量影响微藻生长导致微藻总量不断下降，中途中止试验。我们曾尝试外加氮源支持微藻生长，发现即使在废水中添加150 mg/L的NaN03(此浓度为BG11浓度的1/10)，6d内微藻的生长状况依然可以与在纯BG11中生长状况相同，同样提示在没有生长抑制因子的条件下，废水中氮的缺乏是导致微藻难以持续快速生长的主要原因。而磷的使用效率表明2种栅藻对磷利用率较高，尽管废水的磷氮比例已显著高于BG11，但磷酸盐依然可以在48 h内降低到极低的水平，结合其他文献的研究判断，2种微藻对磷的利用可能有储藏机制，这有利于废水中磷的去除。而且由于氮磷比的变化会有利于小球藻、蓝藻等杂藻生长，因此废水培养系统中应该注意氮磷比对种群优势度的影响。
因此在正式运行中，如采用中水回用培养微藻，必须缩短水力停留时间或者外加氮磷以保证营养供应，受限于微藻采收技术，现有的微藻运行措施无法像活性污泥系统利用污泥回流解决水力停留时间与微生物停留时间不同的问题，水力停留时间的缩短也将导致微藻停留时间缩短，甚至大于微藻生殖周期，使系统崩溃。如何对微藻进行有效的沉淀或回流将是是生产应用中急需解决的问题之一，如胡洪营等提出的利用污水处理中的膜分离技术进行微藻分离和回流是一个较有前景的技术，但其稳定性和可靠性还需要试验验证。
除了营养条件限制外，废水微藻培养的另一个问题是微藻的优势度保持能力，现有的微藻生物柴油与废水处理相结合的研究多限于实验室短批次的培养，废水通常需要经过灭菌、过滤等消毒处理以保持培养产油微藻的优势生长，藻种对废水的适应性及开放式培养条件下微藻优势度的变化都成为限制该项研究的关键因素，我们的前期实验亦表明，硅藻目、金藻目的产油藻种无法在未灭菌的废水中生长，或是很快就被其他微生物所替代。最终选用的2种栅藻均从奶牛场废水中筛选，本身耐污性较好，生长速率高，在高接种量及稳定的培养条件下不易被取代，在半连续试验中南汇废水可以很好地支撑2种微藻的生长，南汇进水的半连续试验共持续了4个月，微藻的优势度均能始终维持在80%以上，显示出良好的应用前景。但2种微藻明显不适应金山废水，半连续培养10 d左右小球藻大量暴发最终导致实验中止，因此，合适的废水来源对于微藻的培养至关重要，另外在成本可控的情况下，利用一定的技术手段去除金山废水中的毒性物质将有利于产油栅藻的生长。而Woertz等采用的混合藻种培养方法也是一种有发展潜力的手段，但在我们的试验过程中发现，最易产生的污染藻种小球藻和颤藻是不含油的藻种，因此如何能保证系统中的优势藻种一直为产油藻种是混合培养模式下急需解决的问题。或者采用更好的办法开发小球藻和颤藻，使得整个废水培养系统如农田的轮作一样进行更替运行，将更有效的降低系统运行成本。
在油脂积累过程中，半连续式培养中的微藻几乎没有油脂的积累，在批式试验运行6d后微藻所积累的油脂也仅有最高含油量的20%，因此在污水氮磷利用后应考虑增加油脂积累的步骤以保证后续油脂提炼工作的效益最大化。
本文的研究结果表明，在合适的环境条件下，利用未处理污水培养产油藻进行连续运行也是可行的，但污水培养的关键问题将是在水力停留时间和微藻停留时间之间找到合适的平衡点，而经济有效的微藻采收回流手段及优势藻种控制技术将是今后的研究重点。
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