作者：郑晓敏
含酚废水的处理主要有萃取、吸附、氧化、膜分离及生物降解等技术，其中生物降解因成本低、污染少而被广泛采纳。研究表明，能降解苯酚的菌属有：假单胞菌属、芽孢杆菌属、酵母菌属、不动杆菌属等，其中研究最多的是假单胞杆菌属。
炼油废水含有烃类、酚类以及NH3 -N等多种污染物，废水量大，COD含量高，硝化率低，NH3 -N脱除不稳定，主要原因是某些有毒有机物对自养硝化菌产生了抑制，而异养硝化菌能利用有机碳源，可消除有机物的抑制，从而提高硝化效果，达到同时脱碳脱氮的目的。笔者从炼油废水生化处理池的活性污泥中筛选出1株能降解苯酚的异养硝化高效菌，并进行了种属鉴定，考察了温度、pH、摇床转速及底物质量浓度对菌株生长及苯酚降解性能的影响，同时对NH3-N的去除和NO2 -N的产生进行了考察，为含酚的氨氮废水的脱碳脱氮技术提供了依据。
1 实验材料和方法
1.1材料
活性污泥：取自武汉市某石油化工厂废水生物处理系统；LB培养基：酵母浸出粉5g/L，氯化钠10 g/L，蛋白胨10 g/L，自然pH；异养硝化培养基：(NH4)2SO4 1.0 g/L, Na2HPO4·12H2O 7.9 g/L,KH2PO4 1.5 g/L, MgSO4 0.1 g/L, FeSO4·7H2O0. 01 g/L，微量元素储备液2 m L，pH=7.0；微量元素储备液：ZnSO4·7H2O 0.12 g/L，MnSO4.H2O0.1 g/L,H3BO3 0.07 g/L,Na2MoO4，H2O 0.04 g/L,CoCl2 0.04 g/L,CuSO4·5H2O 0.02 g/L,p H=8.0。培养基均需在0.1 M Pa、121.5℃条件下灭菌20~30 min,FeSO4．7H2O采用0.22 μm微孔滤膜过滤除菌，苯酚为易挥发性试剂，在培养基灭菌并冷却后再加入。
1.2实验方法
1.2.1 菌株富集及筛选
将新鲜的活性污泥在LB培养基中活化2次后，转接至含有苯酚的异养硝化培养基中进行驯化，驯化时p（苯酚）从200～1 000 mg/L梯度增加，之后采用稀释涂平板和平板划线的方法得到若干株能降解苯酚的异养硝化菌；对各菌株进行苯酚降解及硝化性能测试，将性能最好的1株保种，并进行后续实验。
1.2.2菌种鉴定
菌株形态学的观察和生理生化试验依据《常见细菌系统鉴定手册》进行；DNA提取、PCR产物纯化使用试剂盒完成；16S rD NA测序分析委托武汉擎科生物技术有限公司进行。
1.2.3 菌株生长及苯酚降解条件的选择
在异养硝化培养基中将菌株活化至对数期，按接种量φ ( A)=3%接种至以苯酚为唯一碳源、NH3-N为唯一氮源的异养硝化培养基中，p（苯酚）= 600 mg/L，分别考察培养温度、初始pH、摇床转速及底物质量浓度对菌株生长及苯酚降解性能的影响。
1.2.4 菌株同时脱碳脱氮、同步硝化反硝化能力的研究
将活化后的种子液接种至苯酚质量浓度分别为600 mg/L和800 mg/L的异养硝化培养基中，定期取样测OD600苯酚、NH3 -N及NO2 -N的质量浓度，考察菌株Y10同时脱碳脱氮及同步硝化反硝化的能力。
1.3分析方法
采用4-氨基安替比林法测定苯酚的质量浓度；采用纳氏试剂法测定NH4+ -N质量浓度；
采用N-(1-萘基)-乙二胺光度法测定NO2 -N质量浓度；采用比浊法测定菌体浓度。
2结果与讨论
2.1菌种鉴定
经分离纯化获得19株能降解苯酚的异养硝化菌，选取硝化和苯酚降解性能最好的一株命名为Y10。Y10的菌落形态及革兰氏染色后的照片如图1所示。由图1可以看出，菌落呈圆形，乳白色，隆起，边缘整齐，表面光滑，有荧光色素产生，革兰氏染色呈阴性。生理生化试验结果表明：淀粉水解试验、糖酵解试验、甲基红试验呈阳性，而V -P试验、吲试验呈阴性。
将PCR扩增产物的碱基序列输入到GenBank中进行Blast比对，与Y10同源性较高的部分菌株如表1所示。从表1中可以看出，与Y10同源性达99%以上的均为假单胞菌属（Pseudomonas sp.），结合其形态学及生理学特征，将其鉴定为假单胞菌属。
2.2 Y10生长及苯酚降解培养条件的选择
2.2.1 培养温度的选择
在培养基pH =7.0，摇床转速为200 r/min条件下，培养温度对菌株生长及苯酚降解的影响如图2所示。由图2可见，当培养温度低于25℃时，菌株生长及苯酚降解均比较缓慢；当温度高于30℃时，苯酚去除效果明显加强，且30、35、40℃条件下菌株的生长及苯酚降解效果相当，8h的降解率均达100%，因而适宜Y10生长及苯酚降解的温度为30~ 40℃。
2.2.2初始pH的选择
在温度为35℃，摇床转速为200 r/min条件下，培养基初始pH对菌株生长及苯酚降解的影响如图3所示。从图3可以看出，Y10对培养基pH适应范围较广，pH=6.0~10.0，菌株培养至7.5 h时，苯酚均被完全降解；pH=7.0~9.0条件下，菌株Y10的生长曲线和苯酚降解曲线几乎各自重合，且较其他条件都好，说明中性及偏碱性环境更利于Y10的生
长及代谢。
2.2.3摇床转速的选择
溶解氧是影响好氧微生物生长及代谢的重要因素，在35℃、pH=9.0条件下，不同摇床转速对菌体生长及苯酚降解的影响如图4所示。由图4可以看出，菌株生长与苯酚降解呈正相关，生长速率快所对应的苯酚降解率高；当摇床转速为200 r/min时，Y10生长和苯酚降解效果为最佳，在7h时对600 mg/L苯酚的降解率为100%。
2.2.4底物质量浓度的影响
将Y10接种于pH=9.0的异养硝化培养基中，在35℃、200 r/min条件下，不同底物质量浓度对菌体生长及苯酚降解的影响如图4所示。从图4可以看出，在低质量浓度范围内，OD600随苯酚质量浓度的增加而迅速增大，同时苯酚质量浓度越低，完全降解所需的时间越短。当质量浓度≤1 300 mg/L时，苯酚均能被完全降解，降解能力远高于大部分已发现的苯酚降解菌；当质量浓度≥1 500 mg/L时，菌体停止生长，说明高质量浓度的苯酚对菌株的生长产生抑制，且培养基中苯酚未挥发，说明底物的降解都是因微生物的代谢作用所引起。
2.2.5 菌株脱碳脱氮及同步硝化反硝化性能研究
将Y10接种于p（苯酚）=600 mg/L、p (NH3 -N)=111 mg/L异养硝化培养基中，在最佳培养条件下，苯酚及NH3-N降解、NO2- -N产生及菌株生长曲线如图5(a)所示。从图5(a)中可以看出，在碳源充足的情况下，菌株生长与氨氮、苯酚降解同步，6h苯酚降为零时，NH3 -N降解率为46.8%，继续培养发现，当碳源不足时，菌株生长进入稳定期，同时NH3 -N质量浓度开始反增。
除p（苯酚）=837 mg/L、p（NH3 -N）=114 mg/L外，图5(b)的其他条件同图5(a)。待培养基中苯酚降解完后，以相同的m(C)：m(N)向其中分别补加苯酚576.6、110.9 mg/L。对比图5(a)、图5(b)可以看出，当碳源充足时，菌株将持续生长，同时NH3-N也不断降解，12 h时被完全降解。图(a)、图5(b)中，检测到的NO2 --N质量浓度均较低(≤1.5 mg/L)，这说明菌株Yl0可实现同步硝化反硝化。
3结论
(1)通过分离纯化从石油化工厂的活性污泥中筛选出1株异养硝化苯酚降解菌Y10，鉴定为假单胞杆菌。
(2)菌株Y10适宜的培养条件为：温度为35℃，培养基初始pH =9.0，摇床转速为200 r/min。在此条件下，质量浓度为837 mg/L及1 254 mg/L的苯酚分别在7h和20 h时均被完全降解，降解率分别为119.6 mg/( L.h)和62.7 mg/( L.h)。
(3)在碳源充足的条件下，Y10可使p(NH3 -N)=114 mg/L在12 h时全部降解，且产生的
p (NO2- -N)≤1.5 mg/L，表明该菌可实现同步硝化反硝化。
4摘要：从武汉市某石油化工厂的活性污泥中筛选出1株能降解苯酚的异养硝化菌Y10，通过生理生化试验及16SrDNA测序鉴定其为Pseudonzonas sp．属细菌。该菌生长和降解苯酚的适宜条件为：温度为35℃，培养基初始pH为9．0，摇床转速为
200 r/min。在该条件下，质量浓度为837 mg/L及1254 mg/L的苯酚分别在7h和20 h时被完全降解，降解速率分别为119.6 mg/( L .h)和62,7 mg/(L .h)。以苯酚为唯一碳源且碳源充足时，Y10能将初始质量浓度为114 mg/L的氨氮在12 h时全部降解，该过程产生的亚硝酸盐氮≤1.5 mg/L，表明该菌可实现同步硝化反硝化。
