作者：张毅
维生素D两种主要存在形式为维生素D3和维生素D2，鱼和鸡蛋中含有维生素D3较多，酵母和一些菌类中含有维生素D2。维生素D3和D2是否有等同的生物药效性存在一些争议，一些人认为在增加血清方面25(OH)维生素D2比维生素D2更有效，而有些人持相反的观点。在少量的肉和牛奶中存在维生素D3和25(OH)D3，并且25(OH)D3的生物活性是维生素D3的1.5倍，而有些人持相反的观点。所以在生物活性和他们的分离方面，还需要进一步的研究。一般采用高效液相色谱法，但是对于低含量样品，检出困难。试验使用LC-MS/MS对鱼或者其他肉类的维生素D3和25(OH)D3进行测定，结果满意。
1试验部分
1.1 主要仪器和试剂
高效液相色谱仪：HP 1100，安捷伦科技中国有限公司；三重四极杆质谱仪配有ACPI源：6210，安捷伦科技中国有限公司；高速离心机：TG16MW，上海基屹生物科技有限公司；超声仪：JTS-1072，深圳洁盟清洗设备有限公司；涡轮振荡器：GT-25，奉化市爱比西气动元件有限公司；固相萃取装置：DG-
12B，生海皓庄仪器有限公司。
正相制备柱（Supelcosil LC-Si.5μm,4.6mm×150 mm; Agilent zorbax NH2,5μm,4.6 m m x 150mm)；色谱柱(Symmetry C18，5μm，4.6 mm×250 mm)：-级去离子水；没食子酸：分析纯；KOH:优级纯；无水乙醇：分析纯；己烷、丙酮、乙酸、环己烷、乙二醇、石油醚、乙醚、异丙醇、甲苯、二氯甲烷、甲醇：Thermo-Fisher公司。
1.2标准溶液的配制
维生素D2、D3标准溶液：准确称取适量标准物质，用甲醇稀释至10 μg/m L。 25(OH)D2和25(OH)D3标准溶液：用V（乙醇）：V（甲醇）=1：1稀释至10μg/m L，这些储备液冰
箱-20℃至少保存6个月。
维生素D3标准应用液：取标准储备液用V（甲醇）：V（水）=98：2稀释至10，40，80，120，200和300 n g/m L，每个标准溶液里加内标物质维生素D2 200 n g/m L。
25(OH)D，标准应用液：取标准储备液用V（甲醇）：V（水）=88：12稀释至10，20，40，80，120和200 n g/m L，每个标准溶液里加内标物质维生素25(OH)D2200 n g/m L。这些标准溶液冰箱-20℃至少保存6个月。
1.3样品预处理
1.3.1样品制备
所有具有代表性的猪肉、牛肉、鸡肉、鸡蛋和粉鲑：市售，新鲜的待测样品存放与4 0C的冰箱中。样品制备时鱼样去掉鱼皮，肉类切成5～10 cm2大小的块状，放入绞肉机内绞碎，储存于-20 0C的冰箱中待用。
1.3.2皂化
取1.3.1中均质好的样品10 g，加内标物质含量0.75 m L,在室温下用45 m L 60% KOH和90 m L 1%的没食子酸乙醇溶液皂化处理过夜，离心取上清液，再用300 m L混合有机相V（石油醚）：V（乙醚）=80：20萃取残渣和上清液4次，有机相用300 m L去离子水洗涤分次洗涤3次，在50 0C下氮气浓缩至0.5 m L，再用0.2%异丙醇环己烷溶液溶解吹干的样品。
1.3.3净化
将1.3.2中样品混匀后过SPE净化小柱，维生素D2和D3用10 m L 0.4%异丙醇二氯甲烷溶液洗脱并收集，25(OH)D2和25(OH)D3用10 m L 4.0%异丙醇二氯甲烷溶液洗脱并洗涤。洗脱液通氮气浓缩至干，然后用0.5mL 0.1%异丙醇环己烷溶液溶解并过0.45μm 滤膜。
第二步净化是过半制备型液相色谱柱，安捷伦1100 HPLC系统配有馏分收集器和多波长检测器，维生素D：和D3被2个串联硅胶柱(5μm，15.0 cm×4.6mm)洗脱，洗脱液是0.5%异丙醇己烷溶液，流速1.0mL/min，25(OH)D3被两个串联的氨基柱(5μm，15.0cm×4.6 mm)洗脱，流动相是2.5%异丙醇己烷溶液，流速1.0 m L/min，流动相中加入40 μL乙二醇以保证分析物在溶液中，室温下氮气吹干，流动相200 u L溶解并过0.45 μm滤膜过滤，上机测试。如果需要，连接三重四级杆MS/MS，由于干扰因素比较多，色谱无法分离，25(OH)D3只能用MS/MS测定。
1.4色谱条件
测定维生素D3流动相：98%甲醇／2%水；流速0.4mL/min；进样体积40 μL; HPLC UV-DAD检测器；检测波长265 nm;柱温：40℃。测定维生素25(OH)D，流动相88%甲醇／12%水（含乙酸0.2%）；流速0.45mL/min；进样量40 u L;三重四级杆MS/MS正离子APCI模式。
1.5质谱条件
离子源：大气压化学离子源APCI;源温度：1100C：扫描方式：正离子扫描；检测方式：多反应监测( MRM)；萃取锥孔电压：4 V;电晕放电针电压：3.2 kV; APCI探头温度：450℃；干燥气流速N2: 300 L/h：CID( A r)气流速：2.5 e-3 mbar。MRM监测模式下的参数见表1。
2结果与讨论
2.1前处理条件优化
维生素D3测定时，皂化回收率极低，考虑到这一点，试验选择常温下过夜皂化，这样不浪费时间，皂化完全。以50：50比例的石油醚一乙醚为萃取液，试验发现其很容易形成乳化，使萃取难度加大，降低了乙醚的用量为25%，大大减少了乳化，且回收率不变。
在净化步骤，为了得到纯净的待测物，选择了SPE固相萃取小柱和半制备型液相色谱，事实上，一般的含量稍高的样品只通过正相净化就可以了，然而对一些日用品，维生素D3含量极低，需要大量的样品进行萃取，杂质含量较多，为了减少干扰和噪音，就需要再进一步净化了。猪肉中25(OH)D3的测定就需要进一步净化，为了节省时间，尝试只做固相萃取，跳过正相制备步骤。然而，样品太脏，致使色谱的分离效率极低，需要非常频繁的MS/MS源清洁。谱图如图1所示。
像有些样品如鱼肉，可以不经过固相萃取步骤净化，只进行正相制备，尽管维生素D3含量高达21.1μg/100 g，而25(OH)D3含量低至0.08μg/100 g。其DAD测定色谱图虽然有干扰，但分离效果可以接受。对于鱼类只进行正相制备而跳过固相萃取，维生素D3的含量较高，其检出限为3 n g/100 g，单个紫外检测波长265 nm，可以看出检出限很好，但是没有纯度测试装置。对于复杂样品，DAD或者LC-MS/MS是必要的，尽管DAD的检出限较高。发现测定低含量的维生素D3对于DAD是一个限制，主要因为紫外光谱信号太低的话，纯度测试是不可能实现的，考虑此情况，测定维生素D使用LC-MS/MS是必要地。对于复杂的含量极低的样品如猪肉，LC-MS/MS比UV-DVD的特异性要好，而且检出限也低，线性和重现性都较好。图2是两个样品的25(OH)D2和25(OH)D3多离子检测图。
2.2精密度和回收率
向已测典型样品猪肉试样中加入高、中、低三个水平维生素D3标准0.504，0.302和0.240 μg/100 g，25(OH)D3标准0.250, 0.150和0.120 μg/100 g，按照操作1.3.2进行测定，每个样品平行测定6次，根据加标量与检出量计算回收率和精密度（表2）。结果显示，各物质的回收率为84.2%～102%，精密度的RSD为0.01%～4.19%，达到分析方法的要求。其他检测物的回收率见表3。
2.3线性范围和检出限
分别取上述标准溶液进样，各组分以含量(x)为横坐标，峰面积(y)为纵坐标绘制标准曲线。维生素D3用UV检测器，相关系数为0.999，25(OH)D3用MS/MS测定，其相关系数0.99以上，在10—200 n g/m L范围内线性关系良好。UV和LC-MS/MS测定猪肉样品，方法检出低限按10倍的信噪比算分别为0.10和0.04μg/100 g。
2.4各种肉类中维生素D3和25(OH)D3的含量
采用方法对某采购的样品进行测定，每个平行测定6次，测定结果如表4所示。
3结论
为了得到可靠的信号，采用两步净化样品和内标的方法测定食品中的维生素D3和25(OH)D3，此方法的优点在于可以分析多种低含量物质，并且配有LC-MS/MS,比UV-DCD检测器的特异性要强，且具有较好的检出限。
4摘要建立了HPLC-UV-DAD和LC-MS/MS测定肉中维生素D3和25-OH维生素D3的方法。样品经皂化、有机相萃取和SPE净化小柱后，维生素D3用反相高效液相色谱(HPLC)配有紫外二极管阵列检测器(UV-DAD)检测，维生素25-OH-D3用三重四级杆质谱(APCI-MS/MS)测定，定量采用维生素D3和25-OH维生素D2作为内标物质，有证的标准物质维生素D3和25-OH维生素D3作为质量控制工具。结果表明，2种物质的检出限分别是0.10μg/100 g和0.04 μg/100 g，方法线性范围10～200 n g/m L,相关系数达0.99以上，回收率>84.2%，方法的精密度范围为0.01%~4.19%。该方法适用于测定肉（猪肉、牛肉、鸡蛋和鱼等）中维生素D3和25-OH-维生素D3。
