关于Trichoderma reesei纤维素酶膜反应体系构建的研究

作者：张毅      

  目前利用谷物和薯类的淀粉进行生物乙醇的生产收到国家粮食战略的影响，越来越多的研究集中于研发利用农产品加工残渣、农业残余物以及甘蔗渣等木质纤维素进行生物乙醇的生产。生物乙醇转化过程中面临最主要的挑战是解决提高纤维素酶的利用效率的问题。关于纤维素酶回收重复再利用提高其利用效率技术主要包括3种方法：(1)利用载体进行纤维素酶的固定化；(2)利用吸附剂进行重吸附法回收利用；(3)采用超滤技术进行纤维素酶的回收再利用。而超滤膜技术目前大量应用于不同领域溶液和溶质的分离以及溶质的浓缩，或者生物活性物质以及天然产物中提取有效物质等。超滤技术的最大的特点是其操作过程简便高效。研究主要利用中空纤维超滤膜对纤维素酶进行回收，从而提高其利用率。

  在纤维素酶膜反应体系构建过程中，中空纤维超滤膜的膜壁微孔密布，原液在外界适当的压力条件下通过膜的一侧，酶解的可发酵糖和一些小分子物质能够透过中空纤维超滤膜，为滤出液；而溶液中的纤维素酶等大分子蛋白组分被超滤膜所截留，为截留液，从而实现纤维素酶的重复利用，提高其利用率。研究利用的纤维素酶为里氏木霉（Trichoderma reesei）纤维素酶，根据试验目的研究采用了聚砜中空纤维超滤膜( PS)，选定的超滤膜组件的孔径分别为6、10和30 k Da，分别标记为PS06，PS10和PS30。

1  材料与方法

1.1材料与仪器

  纤维素酶：工业酶制剂，为Trichoderma reesei纤维素酶，来源于甘肃华羚生物科技有限公司。

  试剂：考马斯亮蓝G-250，浓盐酸(37)等分析级；小牛血清蛋白为生物级，Sigma公司。

  超滤膜分离装置：型号TIANFANG-TP-10-20，购自天津膜天膜科技股份有限公司。

  中空纤维素膜：根据膜孔径分为PS6，PS10和PS30三种型号，购自大连先路科技发展有限公司。

1.2方法

1.2.1纤维素酶含量测定

  纤维素酶含量测定利用Bradford方法进行测定，这一方法是目前灵敏度较高的蛋白测定法。首先进行BSA蛋白质标准曲线的绘制。

  首先将21支经过灭菌的试管分3组编号，进行平行试验，根据下述方法(1)依次加入试剂，利用振荡器进行混匀，室温条件下放置30 s后分组编号的试管加入3.5 m L考马斯亮蓝G-250溶液，同时利用振荡器混匀，室温条件下放置10 min后，以0号试管作为空白对照，测定其他编号试管在595 nm处的吸光度。绘制标准曲线，如图1所示。

  纤维素酶蛋白浓度的测定方法如下：

  1)在经高压灭菌试管中，先加入80 μL ddH2O，然后加入一定浓度范围的小牛血清蛋白样品10μL ，加入配制好的HCI10 进行振荡器混匀30 s后，加入3.5 m L考马斯亮蓝G-250溶液，振荡器摇匀，室温放置10 min后在595 nm处测定吸光度。

  2)按照方法(1)在试验过程中测定3个平行样，然后取3个纤维素酶蛋白平行样的平均值，利用图1标准曲线计算纤维素酶的含量。

1.2.2膜通量的测定

  在利用中空纤维超滤膜进行纤维素酶回收利用过程中，要进行膜通量的相关分析，超滤膜分离主要推动力是膜两侧的压力差。利用膜孔径的渗透作用及其选择性截留现象实现溶液体系中根据分子量大小进行膜分离。要达到较好的膜分离效果，体系中不同组分间的相对分子量理论上应该相差一个数量级以上。超滤膜进行纤维素酶蛋白分离浓缩的指标通常以膜通量作为衡量中空纤维素超滤膜组件的性能。膜通量是指超滤膜在单位时间内通过单位膜面积的透过液的体积（L．m-2．h-1）。膜通量计算如公式(1)所示。

  式中：J----膜通量(L．m-2．h-1)；V一通过超滤膜透过液体积(L)；S一有效膜面积( m2)；

t一超滤时间(h)。

  中空纤维素超滤膜组件的纯水渗透系数是指与纯水的膜通量成正比以及与膜两侧的压力差成反比关系。可以用公式(2)进行表示。

  式中：J——超滤膜组件的膜通量(L/m2．h)；L p——纯水渗透系数；△P-----超滤膜两侧的压力差( Pa)。

  超滤膜组件的膜通量衰减比率与纤维素酶溶液膜处理前后的超滤膜组件的纯水透过通量J0和J1有关，可由公式(3)计算出膜通量衰减比率。

 式中：J0一纤维素酶蛋白溶液膜处理前纯水透过通量；Jt——纤维素酶蛋白溶液膜处理后纯水透过通量。

1.2.3纤维素酶理论截留率的测定

  在利用超滤膜对纤维素酶进行回收重复利用提高其利用率的膜分离过程中，由于浓差极化的原因，其截留效果会出现一定的变化。需要对纤维素酶的截留率作进行研究分析。理论截留率的计算方法如公式(4)所示。

  式中：R0——理论截留率；Cp----透过液质量浓度( mg/L)；Cb一原料液质量浓度(mg/L)。

2结果与分析

2.1  超滤膜分离组件的筛选

  根据中空纤维超滤膜的推动力不同，可以在中空纤维超滤膜的外侧或内腔进行加压超滤，可以分为外压式超滤与内压式超滤。内压式超滤是水从超滤膜的内表面向外表面进行超滤，而外压式超滤是水从超滤膜的外表面向内表面进行超滤。

  利用中空纤维超滤膜的主要目的是为了对纤维素酶进行回收利用，提高其利用率，通过截留作用得到浓度更高的纤维素酶，通过膜过滤试验发现内压式超滤膜可以得到的更少的截留液，因此纤维素的浓缩效果更好，可以达到预期目的；对于外压式超滤膜由于设计问题，超滤过程中截留液的量较大，因此浓缩效果相对不很理想。内压式超滤膜被截留液中的组分

（纤维素酶）在超滤膜管内，可以被水直接冲走，而外压式超滤膜中的截留组分则通常存留与膜管之间，因此截留组分无法全部被水冲洗干净，长时间作用非常容易造成浓差极化，因此造成膜通量的衰减现象严重，容易引起超滤膜堵塞。

2.2膜孔径的纯水渗透系数分析

  超滤膜组件的分离特性主要是指超滤膜的膜通量（包括纯水透过通量和溶液透过通量）和对分离组分的截留性能。而纯水渗透作为中空纤维超滤膜组件的一个重要参数，其渗透系数直接和膜孔径有关，能够反映出中空纤维超滤膜的阻力的大小。

  利用去离子水对超滤膜组件进行纯水膜通量的研究分析膜组件的分离性能，对不同控径的中空纤维超滤膜进行研究。各个孔径的中空纤维超滤膜的内外径分别为0.8和1.3 mm．其组件特性如表1所示。

  利用去离子水对超滤膜组件进行纯水渗透性能研究，首先用去离子水对膜组件进行压实，然后测定不同膜孔径膜组件的纯水渗透系数LP，结果如图3所示。

  由图3可以看出，三种孔径的中空纤维超滤膜组件的纯水渗透系数的大小顺序为PS30>PS10>PS06，这说明了三种孔径的中空纤维超滤膜组件的膜阻力大小顺序为PS06>PS10>PS30。因此也说明了中空纤维超滤膜组件的亲水性的大小顺序为PS30>PS10>PS06。

  试验结果表明了中空纤维超滤膜组件的膜孔径越大，膜阻力就越小，同时膜的亲水性就越强。中空纤维超滤膜组件的纯水渗透系数反映了中空纤维超滤膜组件的通透性能，然而在实际的利用中空纤维超滤膜组件进行纤维素酶蛋白浓缩分离的试验过程中，纤维素酶蛋白自身的物理和化学特性对超滤结果也影响巨大，仅仅靠纯水渗透通量并不能说明问题，也不能完全模拟试验结果，需要利用纤维素酶蛋白对膜通量进一步的超滤试验，从而达到中空纤维超滤膜组件对纤维素酶蛋白浓缩分离的性能研究。

2.3膜孔径对纤维素酶膜通量的影响  

在研究中空纤维超滤膜组件的膜孔径对纤维素酶蛋白膜通量影响的过程中，需要考虑浓差极化造成的膜通量衰减的现象，浓差极化的产生的原因是在压力驱动中空纤维超滤膜组件的过程中，被浓缩分离的组分在压力差的推动下，通过对流方式流向中空纤维超滤膜的表面，被截留的纤维素酶蛋白往往容易聚积在中空纤维超滤膜表面，从而造成纤维素酶蛋白在中空

纤维超滤膜表面的浓度高于溶液中纤维素酶浓度的现象。在利用中空纤维超滤膜组件进行浓缩分离纤维素酶蛋白或其他生物活性物质大分子时，浓差极化的存在往往会引起中空纤维超滤膜通量的急剧下降，因此在很大程度上影响了中空纤维超滤膜分离或浓缩效率。往往利用膜通量的衰减程度对膜通量的衰减作用进行衡量。

  利用膜通量衰减对不同膜孔径的中空纤维超滤膜进行纤维素酶蛋白溶液的分离情况分析，结果如图4所示。由图可知，在纤维素酶溶液的超滤过程中，膜通量的衰减和超滤时间基本上呈对数关系，是一个典型的错流超滤模式的标记。

  总的超滤过程通常可以分为2个阶段，超滤膜分离的第一个阶段就是在超滤膜分离前20 min，在分离的前20 min，膜通量出现迅速下降的现象，PS30中空纤维超滤膜组件的膜通量从5 min时的4.2 L／m2．h下降到了2.4 L／m2．h，超滤膜通量下降了大约42.9%；PS10中空纤维超滤膜组件的膜通量从5 min时的3.4 11m2．h下降到了1.98 L/m2．h，超滤膜通量下降了大约41.2%；同样PS06中空纤维超滤膜组件的膜通量从5min时的2.3 L/m2．h下降到了1.59 L/m2．h，超滤膜通量下降了大约30.4%。在超滤膜分离进行到20 min之后的膜通量逐渐趋于平衡稳定状态。超滤膜的膜通量衰减的主要原因是在中空纤维超滤膜的表面吸附纤维素酶蛋白，从而在超滤膜表面形成了浓差极化层。而截留液的浓度对中空纤维超滤膜组件的膜通量影响是间接的，其宏观表现为截留液浓度高、超滤膜的作用时间长都能够加剧PS中空纤维超滤膜的膜通量的衰减。从而降低中空纤维超滤膜的工作效率。结果表明在纤维素酶蛋白进行三种膜处理前后的超滤膜组件的膜通量衰减比率大约都在40%左右，尽管PS06中空纤维超滤膜衰减比率最小，主要原因是在纤维素酶蛋白浓缩分离之前，其纯水透过通量比较小，因而会影响超滤效果。而PS30在纤维素酶浓缩分离之前，其超滤膜的纯水透过通量是最大的。

2.4膜孔径对纤维素酶蛋白截留率的影响

  不同膜孔径的超滤膜组件对纤维素酶蛋白的截留率的影响如图5所示，从图中可以看出PS06，PS10，PS30中空纤维超滤膜对纤维素酶蛋白的截留率分别为99%，98%和95%。

  从不同膜孔径的PS中空纤维超滤膜的纯水渗透系数和对纤维素酶膜通量以及纤维素酶蛋白截留率的综合影响分析，结果发现PS30的对纤维素酶的膜通量较大，虽然其截留率稍低，然而PS06和PS10的膜通量过小，这不利于进行工业化生产，并且Trichoderma reesei纤维素酶蛋白组分中EGI、EGⅡ、EGⅢ、CBH I、CBHⅡ、GB的相对分子量分别为50，46，25，65，58和75 k Da。其中EGⅢ的分子量最小，分子量为25 kDa, PS30的膜孔径大小为30 kDa，然而EGⅢ纤维素酶组分具有一定的空间结构，也不能够通过PS30中空纤维超滤膜进入到透过液中，从而保留在截留液中。

3结论

  利用不同孔径的PS超滤膜对纤维素酶进行回收，从而提高其利用率。在纤维素酶膜反应体系构建过程中，纤维素酶液在外界适当的压力条件下通过膜的一侧，水和无机盐等小分子物质能够透过中空纤维超滤膜；而溶液中的纤维素酶等大分子成分被PS超滤膜所截留，从而实现纤维素酶的重复利用，提高其利用率。试验结果表明：

  1)发现内压式超滤膜能够得到的更少的截留液，因此可能得到浓度更高的纤维素酶，达到试验的理想结果。

  2)超滤膜组件的膜孔径越大，膜阻力就越小，同时膜的亲水性就越强，三种孔径的超滤膜组件的纯水渗透系数的大小顺序为PS30>PS10>PS06，这说明了三种孔径的超滤膜组件的膜阻力大小顺序为PS06>PS10>PS30。

  3)在纤维素酶蛋白溶液超滤的过程中，膜通量的衰减和超滤时间基本上是一个对数关系，这是一个典型的错流过滤模式的标记，PS30在纤维素酶浓缩分离之前，其超滤膜的纯水透过通量是最大的。

  4) PS30的对纤维素酶的膜通量较大，虽然其截留率稍低，然而PS06和PS10的膜通量过小，这不利于进行工业化生产。

4摘要利用不同孔径的PS超滤膜对里氏木霉(Trichoderma reesei)纤维素酶进行回收，从而提高其利用率。在纤维素酶膜反应体系构建过程中，纤维素酶等大分子成分被PS超滤膜所截留，从而实现纤维素酶的重复利用，提高其利用率。试验结果表明：发现内压式超滤膜能够得到更少的截留液，可以得到浓度更高的纤维素酶，达到试验的理想结果。超滤膜组件的膜孔径越大，膜阻力就越小，同时膜的亲水性就越强，三种孔径的超滤膜组件的膜阻力大小顺序为

PS06>PS10>PS30。PS30的对纤维素酶的膜通量较大，其截留率稍低，而PS06和PS10的膜通量过小，这不利于进行工业化生产。