作者：张毅
离子液体双水相萃取技术是近年来发展起来的一项环保、可操作性高以及萃取效率高的新型液液萃取技术，引起了世界各国的研究学者的广泛关注。
2003年，首先报道了向亲水性离子液体中加入磷酸钾水溶液可以形成双水相体系的现象并将之用于分离过程。该双水相体系是由一种有机盐（亲水性离子液体）和一种无机盐（磷酸盐）形成，不同于传统意义的双水相体系。2005年，在室温下用[Omim]BF4/NaH2PO4双水相提取阿莫西林和氨苄青霉素，比较了不同pH对分配系数的影响。结果表明，离子液体与抗生素分子间的静电相互作用对抗生素在双水相中的分配系数有重要影响，抗生素的分
子结构也影响其在离子液体中的溶解度。运用亲水性离子液体从发酵液中提取青霉素G后，用疏水性离子液体[Bminm]PF6对富离子液体相进行了二次萃取，将青霉素G回收到水相中，以此实现离子液体与青霉素的分离，既避免了出现有机溶剂体系中的蛋白乳化现象又解决了混合离子液体双水相体系中的反萃问题，但试验过程比较复杂且要严格控制体系的pH，否则青霉素G很容易降解从而影响萃取率的富集效果。
2005年，[Bmim]BF4/NaH2PO4双水相体系分离了青霉素G钾盐，考察了离子液体用量、青霉素浓度以及NaH2PO4浓度对双水相形成和萃取率的影响，试验中青霉素G的浓度过高，且青霉素G易受pH的影响发生降解。试验采用[Bmim]BF4/(NH4)2SO4双水相体系萃取柱前衍生的青霉素G，并结合高效液相色谱测定。此法操作简便、检测成本低、适用pH范围宽，明显地提高了灵敏度，且有效地避开了离子液体对青霉素G检测的干扰。通过改变离子液体双水相的组成浓度，能够得到较高的萃取率，从而达到很好的富集萃取效果。
1 材料与方法
1.1主要材料、仪器及设备
青霉素G钾标准品，德国Dr. Ehrenstorfer公司；乙腈色谱纯，迪马科技有限公司；1，2，4-三唑，硫酸氢化四丁基铵，氯化汞，萨恩化学技术（上海）有限公司；无水磷酸氢二钠，二水磷酸二氢钠，五水硫代硫酸钠，天津博迪化工股份有限公司；[Bmim]BF4，上海成捷化学有限公司；硫酸铵，西陇化工股份有限公司；试验用水均为哇哈哈纯净水。
Agilent1200型高效液相色谱仪：美国安捷伦科技有限公司；二极管阵列检测器( DAD)；色谱柱Agilent-C18（4.6 mm×150 mm，5μm）：美国安捷伦公司；双光束紫外可见分光光度计：北京普析通用仪器有限公司；低速离心机：安徽中科中佳科学仪器有限公司。
1.2试验方法
1.2.1色谱条件
流动相：A:无水磷酸氢二钠5g，二水磷酸二氢钠10 g，五水硫代硫酸钠4g，硫酸氢化四丁基铵6.5g，用水定容至1 000 m L;B：乙腈（过膜超声备用）。
色谱柱：Agilent-C18（4.6 mm×150 mm，5μm）；检测波长：325 nm;流动相A:流动相B=65：35;检测波长：325 nm;流速：1.00 m L/min;进样量：20μL。
1.2.2标准储备液配置
准确称取10 mg青霉素G标准品用水溶解，定容至10 m L，-20℃避光保存，有效期1个月。
1.2.3青霉素G标准曲线的绘制。
取一定量1.2.2中配置的标准储备液，分别制备100，200，300，400和500μg/m L青霉素G的标准溶液，经过衍生后，在1.2.1色谱条件下进行检测，以峰面积(y)对青霉素G的浓度进行线性回归分析，即得青霉素G的标准曲线方程。
1.2.4离子液体双水相萃取体系的制备
在10 m L玻璃离心管中加入一定量的离子液体[Bmim]BF4及一定量的(NH4)2SO4，加入1 m L已知浓度的按照国标法{汀生后的青霉素G，加水定容至10 m L( 10 g)，震荡至无机盐全部溶解，低速离心机2 500r/min离心15 min，分层后取上相过0.45μm的有机膜，进样20μl，液相检测。
1.2.5 离子液体双水相体系萃取能力测定
按1.2.4所述方法配制双水相体系10 m L( 10 g)，分相后记录上、下相体积（VIL，Vs，用公式(1)计算系统的相比JR和回收率Y。
式中：C0、V0分别为加入双水相体系中青霉素的原始浓度及体积；CIL为离子液体相中青霉素G的浓度。
2结果与讨论
2.1最佳检测波长的选择
试验通过紫外光谱仪确定物质在紫外区检测的最佳波长，分别对青霉素G（图1A）、衍生后的青霉素G（图1B）、[Bmim]BF4（图1C）和衍生后的青霉素G+[Bmim]BF4（图1D）在200～600 nm范围内进行全波长扫描。
从图1A和图1B中可以看出，衍生后的青霉素G在紫外区吸收明显加强，吸收波长为325 nm，这与国标法检测青霉素G的波长相吻合。青霉素G吸收主要集中在200～280 nm之间。试验可知，青霉素G经液相检测的吸收波长为225 nm．然而图1C中离子液体的吸收也集中在这一波长范围内，说明离子液体会对青霉素G检测有很大的干扰二从图1D中可以得出，衍生后的青霉素G吸收波长从225 nm红移到325 nm，灵敏度变高并发生了增色效用，可以有效地避免离子液体的干扰。
2.2高效液相色谱分析
试验通过高效液相色谱仪对离子液体双水相萃取青霉素G在波长225 nm下进行检测，对衍生后的青霉素G在325 nm下进行检测。如图2E所示，在225 nm下，离子液体与青霉素的吸收相近，分离效果不佳；如图2F所示，衍生后的青霉素C的出峰时间为13.458min，能够很好地与离子液体分离，且提高了检测的灵敏度，避开了离子液体吸收的干扰。
2.3青霉素G的标准曲线
以青霉素G的质量浓度对峰面积作图，绘制标准曲线，得到青霉素G标准曲线的回归方程：Y=61.842X-2 030.8．R2=0.998 9，线性范围为100～500 μg/m L，青霉素G的质量浓度与峰面积之间具有良好的线性关系。以10倍信噪比（S/）计算该方法的定量下限( LOQ)为97μg/m L，以3倍信噪比（S/N）计算该方法的检出限( LOD)为29.1μg /m L。根据标准曲线计算青霉素G含量，进而计算离子液体双水相对青霉素G的萃取率。
2.4 (NH4)2S04的量对双水相体系萃取青霉素G的影响
按1.2.4所述方法配制双水相体系10 m L，体系中加入2 m L [Bmim]BF4，10mL已知浓度的青霉素G，再加入不同质量的(NH4)2SO4，用水定容到10 m L。充分震荡溶解后逐渐分层，离心后形成双水相体系。取上相过膜进液相检测，每个样品检测6次。试验结果见表1。
从表1可知，体系的相比R随着(NH4)2SO4的浓度增加而增大，当体系中(NH4)2SO4的浓度到达24.72%时，上相体积不再增加，相比刚保持不变。随着体系中(NH4)2SO4浓度的增大，[Bmim]BF4的疏水性增强，离子液体逐渐从盐水溶液中分离出来。最后，当盐接近饱和时，几乎没有水分配到上相中，最终上相的体积接近于体系中[Bmim]BF4加入的初始体积。
由图3可以看出，随着体系中(NH4)2SO4的浓度增加萃取率也随之增大，当体系中(NH4)2SO4的浓度到达33.11%时，萃取率最高达到85.41%±1.88%，而后下降。这是由于当体系中盐浓度不高时，盐析效应起主导作用，致使青霉素G分配到上相离子液体中的量增加。当体系中(NH4)2SO4的量继续增加到34.13%时，盐的浓度接近饱和，(NH4)2SO4的离子强度影响使[Bmim]BF4与青霉素G之间空间排斥作用以及离子之间的静电力增大，使得青霉素的萃取率有所下降。
2.5 [Bmim]BF4的量对双水相体系萃取青霉素G的影响
在10 m L玻璃离心管中加入3 g(NH4)2SO4，1 m L已知浓度的青霉素G，加入不同质量的[Bmim]BF4，最后加水定量到10 g，使体系中(NH4)2SO4的质量分数为30%。
从表2可知，相比R随着体系中[Bmim]BF4浓度的增加而增大，是由于在固定10 g的体系中，[Bmim]BF4加入的质量增加，加入水的量就会减少，水分配在离子液体相中的量减少。当体系中的盐接近饱和时，上相的体积约等于[Bmim]BF4加人体系的初始体积，所以[Bmim]BF4的量增加，上相体积也增加，相比R增大，相比R会随着离子液体加入量的增加而增加，但萃取率不会因相比的增加而一直增大，综合表1和表2可以得出结论：相比R取决于离子液体双水相的组成浓度，但并不是直接影响萃取率的因素。
由图4可以看出，随着[Bmim]BF4浓度的增加，萃取率逐渐增加，当[Bmim]BF4的浓度达到30%时，萃取率最高达到93.21%±1.32%。，随着离子液体浓度的增加，离子液体的疏水
性增强，而青霉素G易溶于亲水性的环境里，所以当[Bmim]BF4的浓度继续增加超过35%时，萃取率有所下降。通过两组试验得出，萃取的最佳参数为(NH4)2SO424.72%.33.11%、[Bmim]BF4 30%。
2.6 回收率和精密度试验
用[Bmim]BF4质量分数30%/(NH4)2SO4质量分数30%双水相体系对加标100，200和400 μg/m L青霉素G的水溶液进行萃取，每个水平重复6次，结果见表3，回收率为81.37%～92.53%，相对标准偏差RSD为1.86%~2.25%。表明方法可靠，重现性较好。
3结论
试验建立了离子液体双水相萃取柱前衍生结合高效液相色谱测定青霉素G的新方法，在前人研究的离子液体双水相萃取的基础上降低了青霉素G的检测浓度，经过柱前衍生化提高了检测的灵敏度，避开了离子液体对青霉素G检测的影响，并讨论了影响离子液体双水相成相的规律。当(NH4)2SO4的质量分数达到24.72%～33.11%、[Bmim]BF4的质量分数达到30%时，萃取率可达到93.21%±1.32%．方法可靠，灵敏度高，可以避免酸碱体系对青霉素G的降解问题影响其萃取率。[Bmim]BF4/(NH4)2SO4是一个可以有效萃取青霉素G的离子液体双水相体系，具有较高的实用价值，有望为食品、药品中痕量青霉素类抗生素的分离富集及检测提供重要的参考价值。
4摘要建立了离子液体双水相萃取结合柱前衍生测定青霉素CJ的检测方法。由离子液体1-丁基-3-甲基咪唑四氟硼酸盐[Bmim]BF4和(NH4)2SO4构成离子液体双水相体系萃取衍生后的青霉素G，并采用高效液相色谱对其进行检测。考察了离子液体与盐不同浓度组成对萃取效率的影响。结果表明，萃取率受[Bmim]BF4和(NH4)2SO4的浓度影响，当体系中[Bmim]BF4的质量分数达到-30%、(NH4)2SO4的质量分数在24.72%～33.11%之间时，萃取率可达到93.21%±1.42%(n=6)，定量下限(LOQ)为97μg /m L。这一体系能够有效地萃取并检测青霉素G，具有很高的灵敏度和萃取率。
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