关于MALDI-TOF MS技术在肉品研究中应用的研究

作者：郑晓敏   

   MALDI-TOF MS技术已被广泛的应用于有机化学、蛋白质组学、基因研究和药学等领域并拥有独特的潜力与应用前景。基于该技术的诸多特点，其在肉品科学研究中也逐渐得到了应用。研究从MALDI-TOF MS原理出发，将该技术在肉制品成分分析、酶解机理和发酵肉制品菌株筛选鉴定等方面的应用现状进行综述，以期为未来的进一步深入研究打下基础，并为肉制品研究提供新的方法与思路。

1  MALDI-TOF MS技术原理

  MALDI-TOF MS主要由进样系统、离子源、质量分析器、检测器和数据处理系统五部分组成，其仪器构造原理如图1。

  MALDI-TOF MS离子源所采用的电离方式是一种被称为“软电离”的基质辅助激光解析电离，其原理为将极小量的样品与基质混合后点加于靶板上，待样品与基质形成共结晶后用脉冲激光对其进行照射，基质吸收激光的能量跃迁至激发态进而使样品得以电离。待测样品经电离后产生的离子在一定的加速电压下获得动能，并且以一定的速度进入飞行时间分析器（即离子漂移管），其各参数的关系如公式(1)和(2)所示：

式中：U-离子所获得的加速电压(V)，v-----离子进入离子漂移管的速度(m/ μS)，T一离子在漂移管内的飞行时间（μS），L------离子漂移管的长度(m)，m------离子的质量(D a)，z------离子所带的电荷量(e)。

  由公式可知，当加速电压和离子漂移管长度不变的前提下，飞行时间与离子的质核比的平方根成正比，即质量相对较小的离子飞行速度快，故早到达检测器，而质量相对较大的离子飞行速度慢，故晚到达检测器。由此可知，可通过测定离子的飞行时间计算出该离子的原子量或分子量，被测样品按质量数的大小依次被分离，可根据其体现在所得谱图中的谱峰获得每一分子链的分子量，由其谱峰强度计算被测样品的平均分子量和分子量分布宽度，更可在此基础上对被测样品的组成成分、分子结构等进行预测和分析。

  在MALDI-TOF MS技术中，靶板上的基质亦对最终的检测结果起着至关重要的作用，其主要表现在以下三个方面：(1)基质可直接从脉冲激光中吸收能量进而防止高能量将待测大分子物质分解，起到了稳定待测样品的作用；(2)基质可从一定程度上分散待测样品，尽量减小单位体积内待测样品的数量，将其分离成单分子的状态以防止它们发生聚集，以此提高测定的精度；  (3)作为待测样品离子化过程中的质子化试剂。根据待测样品及试验目的的不同（蛋白、多肽、小分子、多糖、脂类和核苷酸等），通常选择不同的基质，目前常用的基质包括a-氰基-4-羟基肉桂酸( CHCA)、介子酸(SA)、2，5-2羟基苯甲酸( DHB)和2-咔啉等。

  此外，随着科技的发展与人们对MALDI-TOF MS技术研究的深入，人们还在离子漂移管的末端加装了反射器，其对飞行至离子漂移管的末端的离子施加电场，改变离子的飞行路径使其进入另一个检测器检测，延长离子的飞行距离，提高质荷比较为接近的离子的测定结果的分辨率。还可以通过在MALDI-TOFMS基础上串联MS/MS的方法以达到对生物大分子的基本结构组成进行测定的目的。

  总而言之，伴随着MALDI-TOF MS技术的日臻成熟，其在原有基础上衍生出了多种特殊而快捷的检测方法与分析手段，如肽质量指纹谱( PMF、源后分解( PSD)等。近年来MALDI-TOF MS技术的应用领域愈发广泛，尤其在肉品科学研究中所占的比重逐渐加大。

  2 MALDI-TOF MS在肉品成分分析中的应用

  肉的主要组成成分包括蛋白质、脂肪、矿物质、维生素、浸出物和水分六大类。它们在肉制品的加工处理过程中均会受到不同程度的影响而发生变化，进而对肉的风味、品质及相关理化特性造成一定的影响。肉中的蛋白质作为肉品研究的重点，其思路正逐渐向性质机理的微观方向延伸。MALDI-TOF MS作为一种快捷高效的研究方法，已广泛应用于肉品科学研究中。

2.1   MALDI-TOF MS对肉品中蛋白质的鉴定

  近年来，蛋白质组学逐渐发展完善，其在肉品中的应用也愈发成熟。MALDI-TOF MS作为一种稳定性高、成本低、进样量小且检测速度快的技术，极适合作为肽质量指纹谱( PMF)的互补辅助技术，以此来对肉中的蛋白质进行辨别筛选与鉴定。

  MALDI-TOF MS技术目前已经广泛应用于2D电泳中，其不仅可以通过与PMF技术的结合来分析肉品种的特异蛋白质和肽段，也可利用对蛋白质的鉴定来推导所测肉样来自于何种畜禽或畜禽的什么部位。采用MALDI-TOF MS与PMF技术，在不需要对基因序列鉴定的前提下，分别确定了猪肉、牛肉和鸡肉中的特征蛋白。其中，经2D电泳分离后90%的猪肉蛋白、70%的牛肉蛋白均可通过MALDI-TOF MS和PMF技术而鉴别出来。

2.2   MALDI-TOF MS对肉品质的鉴定

  MALDI-TOF MS作为一种简单、高效、单一的辅助鉴别手段，其在肉制品品质改良的研究中更是具有广阔的应用前景。通过对畜禽肉的肌肉蛋白进行生物标记，结合MALDI-TOF MS较高的检测分辨率和准确性，可定向建立、检测甚至改良肉制品的某些品质特性。

  不同种类的肌纤维与肉的多汁性、风味和嫩度的关系目前仍不是十分明确。因此，生物标记、2D电泳及MALDI-TOF MS三种技术相结合，以期探求肌纤维与肉品特性的内在关系。其敲除了控制分泌肌肉生长抑制素的一段基因序列上的十三个碱基对，并利用生物标记的方法将其标记。通过此人为的突变，直接导致了不含肌肉生长抑制素蛋白的正常表达。通过MALDI-TOF MS技术分别对基因突变所产生的蛋白、未经突变的正常蛋白进行分析鉴定，对比得出，共产生了13种差异蛋白。这其中包括与肌肉收缩和能量代谢密切相关的蛋白质。此外，肌钙蛋白T受到了基因敲除的影响。由此推断，肌肉生长抑制素与肌肉的收缩程度及糖酵解代谢速度存在一定的联系，且这种抑制蛋白的表达与肉制品的嫩度也存在着某种内在的关联。此外，畜禽肌肉的过度肥大会抑制肌束膜等的组织稳定性及钙蛋白酶抑制蛋白的活性，可以沿用Bouley的思路，通过MALDI-TOF MS与多种生化手段相结合的方法，对该抑制机理进行研究探索。

  畜禽肉品的宰后代谢也是目前应用MALDI-TOEMS技术进行研究的领域之一。畜禽被屠宰后肉品中发生的生理生化代谢反应，对肉品品质有着极大的影响。利用MALDI-TOF MS技术研究发现，宰后猪肉的原料肉中存在着蛋白质组的差异与变化。在其宰后48 h内，一些结构蛋白如肌动蛋白、肌球蛋白和肌钙蛋白T等与宰前相比均出现了不同程度的差异，而部分与代谢有关的酶类，如肌激酶、丙酮酸盐激酶和糖原磷酸化酶等亦表现出一定的变化趋势。此外，一些特异性的代谢酶类开始在胴体内积累，经MALDI-TOF MS对酶解后片段进行检测，发现特异性肌动蛋白和肌球蛋白的碎片含量开始逐渐升高。畜禽宰后肉品嫩度与肌纤维组分的降解有关，而代谢酶类与肉品嫩度的关系并没有做进一步深入的讨论，这些酶类的代谢与蛋白碎片的积累与肉制品的嫩度存在着密切联系，将宰后胴体内的酶类作为一种生物标记物，并令其与肉品嫩度建立内在联系，可作为今后研究的一个方向。

  钙激酶亦对肉品的嫩度有着重要作用。利用MALDI-TOF MS技术研究后，发现了一种以特异钙蛋白酶为介导的，以肌原纤维蛋白为底物的蛋白降解模式。其将肌原纤维蛋白的亚组份与钙蛋白酶在体外混合反应，通过MALDI-TOF MS技术对反应过程中产生的各蛋白组分进行动态监测与测定，发现肌动蛋白、结蛋白、肌钙蛋白和部分原肌球蛋白的亚型均会表现出特异性的降解模式，其降解所产生的肽段与肉品嫩度的关系，则是进一步研究的重点。

  此外，还可以利用MALDI-TOF MS技术对肉品的保水能力进行深入的探讨。肉制品的保水能力是衡量其质量特性的一个重要指标，而保水力与畜禽宰后代谢机制有着重要的联系。早期研究表明，猪体内存在着一种可控制保水能力的单基因模型。则在此基础上发现了与肉品保水性有关的PRKAG3基因（通常也被称为RN基因），通过将2D电泳与MALDI-TOF MS技术相结合，使可以进一步研究猪肉保水能力在分子水平的变化。

  用2D电泳与MALDI-TOF MS技术对韩国本地牛肉背最长肌中的蛋白与该牛肉品质的内在关系进行了探讨。结果表明，分别测定品质评级较高和较低的牛肉蛋白，并对比其蛋白的差异性，发现有7种蛋白出现了差异的表达。在品质评级较高的牛背长肌中，α肌动蛋白表现出了极为高效的表达，而在品质评级较低的牛背长肌中，T-复合物蛋白1(TCP-1)、热休克蛋白β-1( HSP27)以及一种与牛肉品质有关的I型1，4，5-三磷酸肌醇受体蛋白(I P3Rl)则表现出较为高效的表达。此外，分别采用银染法和免疫印迹法对HSP27和I P3Rl进行鉴定，发现它们与牛背长肌中的脂肪含量、嫩度和游离钙的水平存在一定的相关性。因此，HSP27和I P3R1两种蛋白可作为一种指示牛肉品质内在标记物，进一步研究其内在的分子作用机制对提高牛肉品质有着极为广阔的前景。

利用MALDI-TOFS技术专门对小热休克蛋白(sHSPs)与肉制品嫩度的关系进行了阐述。在宰后肉质品成熟的过程中，sHSPs大量的存在且存在一定的动态表达，并作为降解肌原纤维蛋白的伴侣蛋白。小热休克蛋白的功能特性是以磷酸化作用为介导而产生的，同时期也会由大而复杂的小热休克蛋白复合体分解为较小的低聚物。MALDI-TOF MS-术则应用于鉴定小热休克蛋白复合体分解后产生的低聚物的种类，并探索这些低聚物与肉品嫩度的关系。结果表明，HSP20, HSP27和αβ-晶体蛋白等的多种亚型均在肉中有所表达。

  应用MALDI-TOF MS技术，从另一个角度对改善肉制品品质提出了全新的思路。其分别从猕猴桃和芦笋中提取出两种植物蛋白酶，测定它们以牛结缔组织和牛上脑的肌原纤维为底物时的水解能力。宏观的水解程度采用SDS-PAGE的方法直接进行观察，而对于具体某种蛋白的水解程度，则需将该对应条带从胶片上割下，处理后经MALDI-TOF MS技术进行测定。结果表明，猕猴桃蛋白酶对两种底物的酶解效果要优于芦笋蛋白酶，两种蛋白酶对于肌原纤维蛋白和胶原蛋白的作用位点不同，这代表着通过添加外源蛋白酶来改善控制肉制品品质这一思路存在着一定的可行性。

2.3   MALDI-TOF MS对肉制品颜色风味的鉴定

  肉制品颜色与风味也是其品质特性的重要方面，其直接从视觉与味觉上影响消费者对肉制品“好与坏”的主观判断。MALDI-TOF MS技术可应用在肉制品风味、颜色形成机制等的研究中，并已取得了一定的进展。

  肉制品中的风味物质来源多样且组成复杂，其中短肽类物质是风味物质的来源之一。

速食牛肉方便食品中短肽的分布情况。日常食用的食物中所包含的蛋白质具有一定的生物活性和独特风味，这些特性主要归结于短肽（约含由2～50A氨基酸组成）的存在。Bauchart着眼于牛胸肌肉制品中的短肽，该速食牛胸肌肉制品在4 0C保藏14 d后取出并于75 0C加热90 min，利用MALDI-TOF MS技术对短肽的种类与含量进行测定。结果表明，鲜肉中89%的肽类为肌肽、鹅肌肽和谷胱甘肽，而鲜肉经热加工烹调后，这些肽类物质的组分都出现了不同程度的降低。此外，在肉制品的烹调过程中，产生了一定数量的大分子复合基团，其可能是肽类物质的聚集。最后，在烹调后的肉制品中，发现了肌钙蛋白T、伴肌动蛋白、前胶原蛋白和支架蛋白等蛋白的残基。

  通过MALDI-TOF MS技术研究肉制品中由于油脂氧化而引起的一氧化碳肌红蛋白( COMb)褪色的分子机理。通常油脂的氧化会产生氧化产物，其会影响肌红蛋白的氧化还原稳定性，进而使COMb的颜色发生不稳定的变化。试验将4-羟基-2丙烯醛（HNE，一种具有反应活性的油脂氧化产物），与提取自马肉的COMb及氧合肌红蛋白混合，分别在一定的温度、pH条件下反应7d，采用MALDI-TOFMS技术对产物进行分析。结果表明，HNE与COMb在模拟生理条件下( pH 7.4，37 0C)生成了一加、二加及三加化合物，其与氧合肌红蛋白则生成了一加、二加、三加及四加化合物，这说明在模拟生理条件下，COMb与HNE的反应活性要低于氧合肌红蛋白与HNE的反应活性。而在模拟肉制品储藏条件下( pH 5.6，4 0C)，HNE分别与COMb、氧合肌红蛋白反应后，均生成了一加、二加化合物，这说明畜禽肉宰后加工保藏过程中，COMb和氧合肌红蛋白反应趋势基本相近，均是由于醛内收效而赋予肉制品樱桃红般的肉色，且机理基本相同。

  采用MALDI-TOF MS技术与电子舌结合的方法，来分离鉴定河豚鱼中的风味肽类物质。试验从新鲜的河豚鱼中提取风味肽类物质，将分离纯化所得的肽片段依次标记为P1、P2、P3、P4和P5五部分。其中P2进一步通过反向高效液相色谱纯化，依次得到P2a、P2b和P2c三部分。其中的P2b组分鉴定出了甜香味，利用MALDI-TOF MS对P2b组分进行测定，测得氨基酸序列为Tyr- Gly-Gly-Thr-Pro-Pro-Phe-Val，此辛肽化合物水解后的氨基酸残基，是河豚鱼甜香风味的主要来源。

3  MALDI-TOF MS在发酵肉制品中的应用

  MALDI-TOF MS在发酵肉制品中同样可以用于风味多肽物质等的测定。发酵肉制品主要依靠其中微生物的活动，以此达到实现产品特性的目的，故相比一般的肉类或肉制品具有一定的特殊性，MALDI-TOF MS技术在发酵肉制品中主要应用于菌种的检测及鉴定等方面。其能够依据微生物的多种生物标记物进行分析，进而通过测定这些生物标记物的分子量、结构等信息完成微生物的鉴定，

  利用MALDI-TOF MS手段，研究了一种可快速鉴定发酵肉制品中的嗜盐四联球菌的方法。嗜盐四联球菌是一种温和的耐盐的乳酸菌，存在于多种发酵调味品、发酵肉制品中。在研究中，MALDI-TOF MS被演化发展为一种鉴别嗜盐四联球菌的手段。待测样品细胞通常先用乙醇进行洗涤，而后用蚁酸处理，放入基质进行离子化，经MALDI-TOF MS测定后所得谱图与标准菌株谱库中的谱图进行对比，以此确定所测样品中是否含有嗜盐四联球菌。此方法30 min即可得到结果，是一种准确、高效、简便的微生物鉴定方法，在发酵肉制品检测方面有着广阔的应用前景。则在研究热烟熏香肠中部分乳酸菌的热稳定性时，通过MALDI-TOF的方法来对香肠中的特定微生物进行鉴定。则将基因检测技术与MALDI-TOF MS技术有效地联合起来，一方面提高对于醋酸菌16S～23S rRNA转录基因内部间隔区的鉴定精度，另一方门面通过MALDI-TOF MS分析细胞蛋白的组成。

  由以上可知，随着科技的进步，MALDI-TOF MS在微生物研究领域的应用愈加广泛而深入，这为肉品科学中发酵肉制品的研究提供了新的思路与启示，不仅可以准确地阐述某种现象，更可以从更为深入的角度探讨现象背后的本质。

4结语

MALDI-TOF MS作为一种近年来新兴出现的方法，不仅可以单独作为一种有效的检测手段，也可通过与其它技术（如二级质谱、生物标记技术、2D电泳技术和肽质量指纹谱技术等）相结合，进一步拓宽MALDI-TOF MS的应用范围。在肉品科学中，由于MALDI-TOF MS具有准确、高速和高分辨率等特性，因此近年来已被广泛的应用，尤其在肉制品品质改良（如嫩度、风味和颜色）和发酵肉制品微生物鉴定方面，将过去停留于表象的讨论进一步深化，从分子层面和内在机理等角度进行深入阐述。另一方面来讲，MALDI-TOF MS技术由于仪器设备造价较高，导致其在大面积推广层面仍存在着一定的难度。此外，不同样品对应基质的选择等都需要具有一定经验的操作者对其进行筛选优化，对于初学者来说诸多条件仍需要摸索，稍显复杂。总而言之，MALDI-TOF MS技术在肉制品研究中的优势毋庸置疑，随着科技的进步，新的样品制备方法（如靶板上直接进行蛋白质酶解等）、新的基质（混合基质等）以及诸多的新手段新技术，可进一步提高MALDI -TOF MS的流畅性、兼容性和操作简便性，使该方法在肉品科学研究中的应用前景更加广阔。

5摘要基质辅助激光解析电离飞行时间质谱(MALDI-TOF MS)作为一种新颖的质谱技术，其在生物大分子检测、微生物筛选鉴别等方面得到了广泛的应用。该技术可对肉制品中的蛋白、多肽等物质进行鉴定，并可从分子层面探讨肉在不同外界条件下品质变化的机理，故其在肉品科学研究中具有广阔的应用前景。介绍基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱的基本原理，综述其在肉品品质分析等方面的应用，并对该技术在未来肉品科学研究中的前景进行了展望。