浅析血红裸藻多肽的提取及对小鼠运动耐力的影响

作者：张毅               

  血红裸藻多肽是血红裸藻蛋白经过酶水解，精制后获得的肽类，具备抗疲劳以及耐缺氧等多种功能。目前，国内学者在其他藻类多肽提取方面的研究比较多，在血红裸藻多肽的提取方面研究得较少。因此，试验利用响应面分析法对血红裸藻多肽的超声辅助提取条件进行优化，并对其对小鼠运动耐力的影响进行研究，以期为血红裸藻的有效利用和多肽资源的开发提供理论基础。

1  材料及方法

1.1材料与试剂

  血红裸藻：实验室提供；SPF级KM小鼠：广东省医学实验动物中心提供，合格证号为SCXK(粤)2013-0002，8周龄，体重(40+-2g)，共80只，雌雄各半。

  氢氧化钠溶液、盐酸溶液、碳酸钠溶液、脱脂棉、活性炭等：实验室提供；胰蛋白酶、牛血清白蛋白标准溶液：深圳朗特试剂有限公司；Folin试剂、G-75葡聚糖凝胶：广州方大试剂有限公司；血清一氧化氮( NO)试剂盒、超氧化物歧化酶(SOD)检测试剂盒、乳酸( LD)检测试剂盒：广州威美邦试剂有限公司。

1.2试验仪器与设备

  ZFM-3050A型数显超声清洗器：佛山光大仪器有限公司；BJ3-UV2100紫外分光光度计：深圳荣升仪器有限公司；ATL-224-I分析天平：广州新皓仪器设备有限公司；TGL-16型高速离心机：东莞普辉电子科技有限公司；RE-5286A旋转蒸发仪：广州新皓仪器设备有限公司；FD-1A-50真空冷冻干燥机：佛山光大仪器有限公司；GZX-9070 MBE电热恒温鼓风干燥箱：东莞万达仪器有限公司。

1.3试验方法

1.3.1血红裸藻多肽提取及纯化工艺流程

  1)血红裸藻多肽超声辅助提取工艺流程：血红裸藻除杂->洗净->风干->称量->剪碎->加水浸提->脱脂棉过滤->调pH->胰蛋白酶酶解->超声辅助提取->离心 ->上清液活性炭吸附->减压浓缩->冷冻干燥->血红裸藻多肽粗品。

  2)血红裸藻多肽纯化工艺流程；血红裸藻粗品->水解->截留分子量100 kDa透析袋透析->截留分子量50 kDa透析袋透析->截留分子量10 kDa透析袋透析->冷冻干燥斗溶解G-75葡聚糖凝胶过滤->收集->真空浓缩->冷冻干燥->血红裸藻多肽纯品。

1.3.2血红裸藻多肽含量的测定

  1)采用Folin-酚法测定血红裸藻多肽的提取率。标准曲线的绘制：各取牛血清白蛋白标准溶液( 250μg/m L)0.2, 0.5，0.9，1.5, 2.0和2.5 m L于6只容量瓶中，定容，以蒸馏水为空白，于215 nm处测定系列标准溶液的吸光度。经统计回归处理，得到线性方程为y=0.901 2x-0.032 7，R2=0.999 5，x-标准品的浓度，y-吸光度。

  血红裸藻多肽提取率的测定：将上述经过纯化的得到的血红裸藻多肽，稀释，取1 m L_上述血红裸藻多肽溶液到比色管中，加3 mL Na2CO3溶液，恒温水浴3 min后，再加1.0 m L Folin试剂，摇匀，恒温水浴25 mm，同标准曲线法测血红裸藻多肽的含量。

  2)血红裸藻多肽提取率=(C×V×n)/m×100%。

  式中：C-测得的浓度，mol/L; V-体积，L；n-稀释倍数；m-所用血红裸藻的质量，g。

1.3.3血红裸藻多肽超声提取条件的优化

  通过单因素试验考察超声功率、超声提取时间、胰蛋白酶用量和pH对血红裸藻多肽提取效果的影响，在选取各因素的最优试验范围，采用响应面分析法对血红裸藻多肽超声提取条件进行优化。

1.3.4血红裸藻多肽对小鼠运动耐力影响的试验

  1)动物分组与给药方式：实验室温度为15 0C。将小鼠适应性培养2d，2d后在倾斜度为120的动物跑台进行适应性跑步训练。最开始3d，速度为12 m/min，每天训练15 min。之后4 d，速度为15 m/min，每天训练15 min。休息1d。剔除未能学会跑步的小鼠40只，剩下40只小鼠进入试验。将小鼠随机分为4组，每组10只，抽签分为生理盐水对照组、低剂量组、中剂量组和高剂量组。相应地喂食血红裸藻多肽10 d后，在倾斜度为120的动物跑台进行力竭运动试验。当小鼠跑步至力竭，驱赶无效时，即停止试验，记录时间与进行取血试验。

  2)指标测定：小鼠的力竭运动时间；心脏取血，全血经过离心，取上清液，测定血清一氧化氮( NO)含量和超氧化物歧化酶(SOD)含量。

2结果与分析

2.1  血红裸藻多肽超声提取条件的优化

2.1.1超声功率对血红裸藻多肽提取效果的影响

  设定超声提取时间为20 min，胰蛋白酶用量为4%，pH为9.0，分别在超声功率为160，200，240，280, 320和360 W六个梯度下，按方法1.3.1提取血红裸藻多肽并且测其提取率。由图1可以看出，超声功率为240 W时，血红裸藻多肽提取效果较好。

2.1.2超声提取时间对血红裸藻多肽提取效果的影响

  设定超声功率为240 W，胰蛋白酶用量为4%，pH为9.0，分别在超声提取时间为10，15，20，25，30和35 min六个梯度下，按方法1.3.1提取血红裸藻多肽并且测其提取率。由图2可以看出，超声提取时间为20 min时，血红裸藻多肽提取效果较好。

2.1.3胰蛋白酶用量对血红裸藻多肽提取效果的影响

  设定超声功率为240 W，超声提取时间为20 min，pH为9.0，分别在胰蛋白酶用量为1%，2%，3%，4%．5%和6%六个梯度下，按方法1.3.1提取血红裸藻多肽并且测其提取率。由图3可以看出，胰蛋白酶用量为4%时，血红裸藻多肽提取效果较好。

2.1.4 pH对血红裸藻多肽提取效果的影响

  设定超声功率为240 W，超声提取时间为20 min，胰蛋白酶用量为4%，分别在pH为5.0，6.0，7.0，8.0，9.0和10.0六个梯度下，按方法1.3.1提取血红裸藻多肽并且测其提取率。由图4可以看出，pH为8.0时，血红裸藻多肽提取效果较好。

2.1.5血红裸藻多肽的优化试验

  结合单因素试验的结果，分别选取超声功率为200，240和280 W，超声提取时间为15，20和25 min，胰蛋白酶用量为3% .4%和5%，pH为7.0，8.0和9.0，利用响应面分析法优化血红裸藻多肽提取最佳工艺参数。因素水平见表1，结果见表2。

  对血红裸藻多肽提取进行分析，超声功率、超声提取时间、胰蛋白酶用量、pH都是显著因素。关于血红裸藻多肽的提取率二次回归拟合方程：

  提取率=0.41- 5.946E-003×A+ 0.012×B- 7589E-003×C+0.024×D+ 0.038×AB- 8.750E-003×AC+ 8.142E-003×AD+0.014×BC+ 2.804E-003×BD- 3.750E-003×C D- 0.018×A2-0.025×B2-0.029×C2-0.029×D2。其中，A-超声功率，B-超声提取时间，C-胰蛋白酶用量，D-pH。

  由表3可以看出，模型的p<0.000 l，而失拟项的p值为0.540 0，说明了血红裸藻多肽提取的模型与实际情况拟合程度比较好，可以预测血红裸藻多肽提取的条件。

  由方差分析结果可以看出，AB的交互作用、AC的交互作用、AD的交互作用、BC的交互作用、CD的交互作用都显著，根据血红裸藻多肽提取试验结果和回归方程各项的方差分析，由响应面分析法优化出血红裸藻多肽提取最佳工艺条件为超声功率为254.2 W，超声提取时间为22.7 min，胰蛋白酶用量为3.8%，pH为8.5。

2.2血红裸藻多肽对小鼠运动耐力影响试验

2.2.1血红裸藻多肽对小鼠力竭运动时间的影响

  从表4可以看出，随着血红裸藻多肽浓度的增加，血红裸藻多肽低剂量组、中剂量组和高剂量组的小鼠力竭运动时间逐渐增加，小鼠力竭运动时间分别延长了6.97%，14.27%和35.78%。而且，与对照组相比，血红裸藻多肽高剂量组差异十分显著。因此，血红裸藻多肽可以延长力竭运动时间，延缓运动疲劳的发生，提高运动耐力。

2.2.2血红裸藻多肽对小鼠血清NO含量、SOD活力的影响

  从表5可以看出，小鼠经过运动训练后，随着血红裸藻多肽浓度的增加，血红裸藻多肽低剂量组、中剂量组和高剂量组的小鼠血清NO含量依次增加。与对照组相比，血红裸藻多肽组的小鼠血清NO含量高于对照组，特别是，血红裸藻多肽高剂量组的小鼠血清NO含量比对照组高55.11%。血红裸藻多肽促进小鼠的组织释放NO，舒张了血管平滑肌，使得小鼠的组织血管舒张，血液流动加快，从而提高小鼠组织运动耐力。

  随着血红裸藻多肽浓度的增加，血红裸藻多肽低剂量组、中剂量组和高剂量组的小鼠SOD活力逐渐增加。与对照组比较，小鼠SOD活力也明显提高，当血红裸藻多肽含量达到3.00 g/kg，差异显著，SOD活力提高了45.31%。血红裸藻多肽增加SOD活力，加快了自由基的消除和抑制了自由基的生成，从而缓解了自由基对细胞膜的攻击，使得小鼠组织运动耐力提高。

3结论

  血红裸藻多肽提取最佳工艺条件为超声功率为254.2 W，超声提取时间为22.7 min，胰蛋白酶用量为3.8%，pH为8.5。

经过运动训练后，相对于生理盐水对照组，血红裸藻多肽组的小鼠力竭运动时间分别延长了6.97%，14.27%和35.78%。而且，小鼠的血清NO含量增加和SOD活力提高。因此，血红裸藻多肽能较好地提高小鼠运动耐力。

4摘要试验以血红裸藻为原料，研究血红裸藻多肽的响应面提取工艺及其对小鼠运动耐力影响。研究结果表明：血红裸藻多肽提取最佳工艺条件为超声功率为254.2 W,超声提取时间为22.7 min,胰蛋白酶用量为3.80A，pH为8.5。通过测定小鼠力竭运动时间、运动后血清一氧化氮(NO)含量、超氧化物歧化酶(SOD)活力，研究血红裸藻多肽对小鼠运动耐力影响。结果表明，相对于生理盐水对照组，血红裸藻多肽组的小鼠力竭运动时间分别延长了6.97%，14.27%和35.78%，小鼠的血清No含量和SOD活力提高。血红裸藻多肽能较好地提高小鼠运动耐力。