浅析石榴皮多酚体外抗氧化作用

作者；张毅              

  人体内的自由基参与正常生命活动的许多重要反应，但过量的自由基造成体内发生氧化应激，从而介导细胞物质的损伤，引起多种疾病的发生和恶化。而抗氧化剂能够有效地清除自由基，石榴皮多酚是一种常见的天然抗氧化剂，通过模拟体外对常见的自由基的清除作用，可以初步判定其抗氧化能力。为此，通过石榴皮多酚初提物、纯化物及没食子酸对DPPH自由基、羟自由基和超氧阴离子的清除作用及其对脂质过氧化的抑制作用，比较其体外抗氧化能力，对石榴皮多酚活性的进一步研究及其石榴资源的深度开发利用提供一定的科学依据。

1  材料与方法

1.1材料与仪器

  石榴皮：成都中药饮片公司；二苯代苦味酰肼( DPPH)自由基：Sigma公司；2-硫代巴比妥酸：上海科丰化学试剂有限公司；其他试剂均为分析纯，成都科龙化工试剂厂，均在试验前新鲜配制。

  TB-214型电子天平：美国丹佛仪器设备厂；HH-S型数显恒温水浴锅：金坛市金城国胜实验仪器厂：UV-2600型紫外可见分光光度计：上海尤尼柯仪器有限公司。

1.2试验方法

1.2.1石榴皮多酚初提物和纯化物的制备

  试验方法制备石榴皮多酚。石榴皮干燥粉碎，过80～100目筛，采用微波辅助提取，以

水为提取溶剂，料液比为1：30( g/m  L)，提取温度为75 0C，提取时间为140 s，得到的提取液旋转蒸发浓缩后，石榴皮多酚含量为49.31%，冷冻干燥即得石榴皮多酚粗提取物，备用。

  石榴皮多酚粗提取物采用D101大孔树脂进行石榴皮多酚的纯化，石榴皮溶液进柱质量浓度为10 mg/m L，流速为2 BV/h，清洗用水5 BV，乙醇洗脱剂的体积分数为70%，用量为5.5 BV，纯化后石榴皮多酚质量分数为7 1.64%，冷冻干燥即得石榴皮多酚纯化物，备用。

1.2.2石榴皮多酚对DPPH自由基的清除作用

  试验方法：精确吸取不同浓度的样品液1m L于试管中，加入0.04 mg/m L的DPPH乙醇溶液2 m L，摇匀，静置30 min后在517 nm处测定其吸光度A i，同时以无水乙醇1mL代替样品为空白对照A0，同时以石榴皮粗提取物和没食子酸做比照，对DPPH自由基的清除率计算公式为：

1.2.3石榴皮多酚对羟自由基的清除作用

  试验方法并做适当改进：取0.75 m mol/L邻二氮菲溶液1 m L，加入pH 7.4的PBS溶

液2 m L和蒸馏水1 m L，充分混匀后，加入0.75 m mol/L硫酸亚铁溶液1mL，而后加入0.01%的过氧化氢1m L,于37℃保持60 min，在536 nm处测吸光度为A p；用1 m L乙醇代替1 m L过氧化氢，测得吸光度A b1 m L试液代替蒸馏水，测得吸光度As。同时以石榴皮粗提取物和没食子酸做比照，计算清除率H的公式为：

1.2.4石榴皮多酚对超氧阴离子自由基的清除作用

  试验方法并做适当修正：取0.05 mol/L，pH 8.2的Tris-HCl缓冲液4.5 m L于试管中，25 ℃水浴预热20 min，然后加入待测样品0.1 m L和25℃ 预热的2.5 m mol/L的邻苯三酚溶液0.5 m L，混匀后，25℃ 水浴反应4 min，然后加入8 mol／L盐酸两滴终止反应。在299 nm处测吸光度。空白组以0.1 m L蒸馏水代替待测样液，背景组加样品溶液但不含令B苯三酚溶液的吸光度。同时以石榴皮粗提取物和没食子酸做比照，计算公式：

1.2.5石榴皮多酚对脂质过氧化的抑制作用

  试验方法：取新鲜小鼠的肝脏洗净血污，剪碎，用生理盐水制成3%的匀浆。取此匀浆0.6 m L，加入各种试剂，反应液总体积为1.34 m L。含不同浓度料液0.34mL，0.002 4%的过氧化氢0.2 m L, 0.03 m mol/L硫酸亚铁溶液0.2 m L，于37℃水浴保温60 min后，加入2 m L 20%三氯乙酸及2 m L 0.67% TBA溶液，90℃保温15 min后，用水冷却至室温，4 000 r／min离心20 min，取上清液，在532 nm处测得吸光度，以水代替TBA的平行试验管调零，同时用蒸馏水做空白，以石榴皮粗提取物和没食子酸做比照，脂质过氧化抑制率，为：

2结果与分析

2.1石榴皮多酚对DPPH自由基(．DPPH)清除作用结果比较

  将冷冻干燥后的石榴皮粗多酚、石榴皮多酚和没食子酸依次制成5，10，15，20，25和30 mg/L六种不同质量浓度的待测溶液，按1.2.2的试验方法进行DPPH自由基清除作用的测定，试验结果如图1所示。

  体外清除自由基能力可以用清除50%自由基所需样品的质量浓度来表示，即半清除浓度来表示。半清除浓度越小，样品清除自由基的能力则越强，体外抗氧化作用越强，反之亦然。由图1可知，DPPH自由基的清除率对石榴皮多酚粗提物、纯化物和没食子酸质量浓度的回归方程分别为y=2.490 3x+15.012（R2=0.977 8），y=2.254 3x+6.226 7(R2=0.973 2),y=2.130 7x+14.365( R2=0.977 2)，由此回归方程得到对应的半清除浓度EC50分别为14.05，19.42和16.72 mg/m L。半清除浓度越低，说明其抗氧化能力越强。由此可知，石榴皮粗多酚、石榴皮多酚和没食子酸对DPPH自由基的清除作用，石榴皮粗多酚最强，没食子酸次之，石榴皮多酚纯化物最弱。

2.2石榴皮多酚对羟自由基(．OH)清除作用的结果比较

  同2.1将三种不同的待测液依次制成20，30，40，50，60和70 mg/L六种不同质量浓度的溶液，按1.2.3的试验方法进行羟自由基清除作用的测定，试验结果如图2所示。

  由图2可知，羟自由基的清除率H对石榴皮多酚粗提物，纯化物和没食子酸质量浓度的回归方程分别为y=1.223 1x+8.547 4(R2=0.979 2),y=1.382 1x+8.358 2( R2=0.962 5),y=1.504 7x+1.456 6(R2=0.972 0),由此回归方程得到对应的半清除浓度HC50分别为33.89，30.13和32.26 mg/m L。由此可知，石榴皮粗多酚、石榴皮多酚和没食子酸对羟自由基的清除作用，石榴皮多酚纯化物最强，没食子酸次之，石榴皮粗多酚最弱。

2.3石榴皮多酚对超氧阴离子自由基()清除作用的结果比较

  同2.1将三种不同的待测液依次制成2 000，3 000，4 000,5 000,6 000和7 000 mg/L六种不同浓度的溶液，按1.2.4的试验方法进行超氧阴离子自由基清除作用的测定，试验结果如图3所示。

  由图3可知，超氧阴离子自由基的清除率S对石榴皮多酚粗提物、纯化物和没食子酸浓度的回归方程分别为y=0.011 6x+5.577 6(R2=0.964 1)，y=0.013 3x-2.782 5(R2=0.982 7),y=0.015 8x-11.782( R2=0.961 2)，由此回归方程得到对应的半清除浓度IC50分别为3 829.52,3 968.61和3 910.25 mg/m L。由此可知，石榴皮粗多酚、石榴皮多酚和没食子酸对超氧阴离子自由基的清除作用，石榴皮粗多酚最强，没食子酸次之，石榴皮多酚纯化物最弱。

2.4石榴皮多酚对脂质过氧化的抑制作用结果比较

  同2.1将三种不同的待测液依次制成5，10，15，20，25和30 mg/L六种不同质量浓度的溶液，按1.2.5的试验方法进行脂质过氧化的抑制作用测定，试验结果如图4所示。

  由图4可知，脂质过氧化的抑制率对石榴皮多酚粗提物、纯化物和没食子酸质量浓度的回归方程分别为y=1.520 9x+21.333(R2=0.953 6),y=2.189 9x+15.459( R2=0.984 6),y=2.239 4x+18.836(R2=0.982 5),由此回归方程得到对应的半清除浓度IC50分别为18.85, 15.77和13.92 mg/m L。由此可知，石榴皮粗多酚、石榴皮多酚和没食子酸对脂质过氧化的抑制作用，没食子酸最强，石榴皮多酚纯化物次之，石榴皮粗多酚最弱。

3结论

  石榴皮多酚粗提物、纯化物和没食子酸的体外抗氧化作用表明，其对DPPH自由基、羟自由基和超氧阴离子自由基的清除能力以及对脂质过氧化的抑制能力与其质量浓度呈较好的线性关系，随着待测液质量浓度增加而增大。三者在对不同体外自由基的清除作用体现出的抗氧化能力存在一定的差异，在对DPPH和超氧阴离子自由基的清除作用上，石榴皮粗多酚最强，石榴皮多酚纯化物最弱；但在对羟自由基的清除作用上，石榴皮多酚纯化物则最强，石榴皮粗多酚最弱；在对脂质过氧化的抑制作用上，没食子酸最强，石榴皮多酚纯化物次之，石榴皮粗多酚最弱。说明石榴皮多酚在体外具有较强的抗氧化作用。

4摘要对石榴皮多酚体外抗氧化作用进行比较研究。以没食子酸和石榴皮多酚粗提物作对照，探究了其对DPPH自由基、羟自由基和超氧阴离子自由基的清除作用以及对脂质过氧化的抑制作用，通过各自的半清除浓度来表征其抗氧化能力的强弱。结果表明，石榴皮多酚粗提物、纯化物和没食子酸在对不同体外自由基的清除作用存在一定的差异，在对DPPH和超氧阴离子自由基的清除作用上，石榴皮粗多酚最强，半清除浓度分别为14.05和3 829.52 mg/m L，而石榴皮多酚纯化物最弱；但在对羟自由基的清除作用上，石榴皮多酚纯化物则最强，石榴皮粗多酚最弱，其半清除浓度分别为30.13和33.89 mg/m L;在对脂质过氧化的抑制作用上，没食子酸最强，石榴皮多酚纯化物次之，石榴皮粗多酚最弱，半清除浓度分别为13.92，15.77和18.85 mg/m L。在体外石榴皮多酚具有较强的抗氧化作用。