关于 胃蛋白酶、胰蛋白酶提取革胡子鲶下脚料中卵磷脂的酶解条件的研究

作者：郑晓敏

  胡子鲶（Clarias leather），属鲇形目、胡子鲶科。属于热带、亚热带鱼类，广布于我国南方各地，既是营养丰富的消费品，又是具药用价值的滋补品，其头部、内脏含有大量的卵磷脂，若能充分利用鱼类的下脚料来提取卵磷脂，将变废为宝，大大促进经济的发展。

1  材料与方法

1.1材料与试剂

  革胡子鲶鱼头和内脏，北京新辣道餐饮管理有限公司；胃蛋白酶（生化试剂），天津市致远化学试剂有限公司；胰蛋白酶（生化试剂），上海源叶生物科技有限公司；木瓜蛋白酶（生化试剂），江苏锐阳生物科技有限公司；磷酸二氢钾（分析纯），天津市北辰方正试剂厂；钼酸铵（分析纯），上海埃彼化学试剂有限公司；对苯二酚（分析纯），天津市北方天医化学试剂厂；硫酸（分析纯），深圳市庆茂化工有限公司；乙酸钠（分析纯），天津市致远化学试剂有限公司；乙酸（分析纯），济宁恒泰化工有限公司；无水乙醇（分析纯），天津市恒兴化学试剂有限公司。

1.2仪器与设备

  电子分析天平FA1004B：上海佑科仪器有限公司；组织捣碎机JJ-2:金坛市万华实验仪器厂；pH计：烟台凯米斯仪器有限公司；恒温水浴锅HH-6:江苏省金坛市荣华仪器制造有限公司；旋转蒸发仪RE-2000B:上海亚荣生化仪器厂；紫外分光光度计UV-1601:北京北分瑞利分析仪器（集团）公司。

1.3试验方法

  试验采用乙醇提取法，在3g革胡子鲶下脚料分别加入胃蛋白酶、胰蛋白酶，在一定温度、pH下进行预处理一段时间后，再用乙醇提取。在得到的卵磷脂粗提液中，加入钼酸铵显色，用分光光度计测量吸光度，计算产品中的磷含量。磷含量的测定法参照钼蓝光比色法（按GB/T 5537-2008进行）。

  磷含量：粗产品中磷的质量(g)／所称的鱼下脚料质量(g) x100%  (1)

2结果与讨论

2.1标准曲线的制作

  配制一系列磷酸二氢钾标准溶液，分别加入钼酸铵硫酸溶液震荡摇匀，溶液变为亮黄色后各加1 m L对苯二酚硫酸溶液震荡摇匀，溶液变为绿色后加入1mL 50%醋酸钠溶液定容至刻度，待溶液变为蓝色时测定吸光度，绘制出磷酸二氢钾中磷含量的标准曲线，如图1所示。

  从图1中可以看出，磷的浓度与吸光度呈线性关系，且R2=0.997 2，拟合程度非常好。其回归方程为：y=0.013 9x+0.021 6。

2.2两种酶酶解条件比较

2.2.1  两种酶的添加量比较

  由于胃蛋白酶适宜在酸性条件下进行反应，胰蛋白酶适宜在碱性条件下进行反应，因此，在pH=3和8时，温度为37 0C时，向革胡子鲶下脚料匀浆中分别添加胃蛋白酶和胰蛋白酶的酶量(添加量=m酶 /m原料×100%)为0,0.005%, 0.025%, 0.03%, 0.035%,0.04%, 0.045%和0.055%，酶解时间均为40 min，然后加入乙醇提取，由此比较了两种酶的添加量对卵磷脂提取的影响．结果见图2所示。

  从图2中可以看出，在不添加酶进行常规提取时，磷含量都低于添加酶提取后的磷含量。随着两种酶的添加量的增高，磷含量均是先升高后下降；而在相同酶添加量时，胰蛋白对卵磷脂提取后磷含量明显偏高；二者的最适添加量不同，胃蛋白酶的最佳添加量为0.075%，此时卵磷脂中磷含量为0.98%，胰蛋白酶的最佳添加量为0.015%，远远低于胃蛋白酶的添加量，而最高磷含量可高达1.48%，远远高于胃蛋白酶提取时的最高磷含量。说明在添加量上，胰蛋白酶的提取能力更强些。

2.2.2两种酶的酶解时间比较

  在pH为3和8时，温度为37 0C时，向革胡子鲶下脚料匀浆中分别添加0.075%的胃蛋白酶、0.015 %的胰蛋白酶，酶解时间分别为40，60，80，100和120min，然后加入乙醇提取，比较两种酶的酶解时间对卵磷脂提取的影响，结果见图3所示。

  从图3可以看出，随着酶解时间的增加，磷含量均是是先升高后降低，二者都是在酶解时间为80 min时，磷含量最高，提取效果最好，此时胰蛋白酶提取卵磷脂的磷含量为1.32%，只比胃蛋白酶提取的磷含量1.30%略高，二者在此时提取效果相当。

2.2.3  两种酶的酶解温度的比较

  在pH 3和8时，向革胡子鲶下脚料匀浆中分别添加0.075%的胃蛋白酶、0.015%的胰蛋白酶，酶解时间均为80min，酶解温度分别设定为25℃，30℃，35℃，37℃，40℃和45℃，然后加入乙醇提取，比较两种酶的酶解温度对卵磷脂提取的影响，结果见图4所示。

  从图4可以看出，随着酶解温度的升高，磷含量均是先升高后降低，在37 ℃时，两种酶提取效果都最好。温度过高，酶容易变性，卵磷脂也容易分解。但在相同酶解温度下，胰蛋白提取的磷含量都远远高于胃蛋白酶，由此可见，胰蛋白酶的提取效果好于胃蛋白酶。

2.2.4两种酶的酶解pH的比较

  在37℃时，向革胡子鲶下脚料匀浆中分别添加0.075%的胃蛋白酶和0.015%的胰蛋白酶，酶解时间均为80 min，酶解pH分别设定为1，2，3，4，5，6，7，8，9，1 0和11，然后加入乙醇提取，比较两种酶的酶解pH对卵磷脂提取的影响，结果如图5所示。

  从图5可以看出，随着pH的增大，磷含量均是先上升后下降，酶解pH过高和过低都会影响提取效果，但两种酶适合的pH范围及最适pH均差异很大。胃蛋白酶适合在酸性条件下使用，最适pH为3；胰蛋白酶适合在碱性条件下使用，最适pH为9。在各自的最适添加量和适宜的pH范围下，胰蛋白酶提取的磷含量均远远高于胃蛋白酶。

  通过以上酶解条件的比较，现将两种酶的不同条件下的特点总结如表1。

  从表1中可以很明显的看出来胰蛋白酶在提取革胡子鲶下脚料中卵磷脂的提取率高于胃蛋白酶。

3结论

  在试验中，对胃蛋白酶和胰蛋白酶提取革胡子鲶下脚料中卵磷脂的酶解条件进行比较研究，得出了如下的结论：

  1)试验中提取的原材料为北京新辣道餐饮管理有限公司提供的革胡子鲶下脚料，包括鱼头和内脏，在试验过程中发现，鱼内脏容易捣碎，再利用酶解处理后能明显看出来内脏组织变得更加糜烂，使卵磷脂更加容易提取。

  2)胰蛋白酶和胃蛋白酶的最佳酶添加量，最佳酶解时间，最佳酶解温度，最佳酶解pH均不相同；分别在这些条件下，胰蛋白酶对卵磷脂提取的磷含量都高于胃蛋白酶。其中，两种酶的pH范围和最适pH相差很远。

试验对利用酶解法提取鱼下脚料中卵磷脂的方法进行了探索，对于水产业能否废物利用提供了应用基础。

4摘要利用胃蛋白酶、胰蛋白酶分别对革胡子鲶下脚料进行预处理，采用乙醇溶剂提取法提取卵磷脂。通过单因素试验，比较了两种酶的酶添加量、酶解时间、酶解温度、酶解pH对革胡子鲶下脚料中卵磷脂提取的影响，其结果为：胃蛋白酶和胰蛋白酶的最佳酶添加量分别为0.075%、0.015%;最佳酶解时间均为80 min;最佳酶解温度均为370C；最佳酶解pH分别为3，9，差异很大；分别在这些条件下，胰蛋白酶对卵磷脂提取的磷含量都高于胃蛋白酶。