响应曲面法优化黑青稞花青素的提取工艺

  陈建国1，梁寒峭1，李金霞1，程池1，郭积新2

  1中国食品发酵工业研究院（北京100015）；2．青海省玉树州囊谦县农牧科技水务局（囊谦815200）

摘要  以囊谦黑青稞原料，在单因素试验基础上，以乙醇体积分数、液料比、提取温度、提取时间和pH为响应因素，利用Box-Behnken中心组合试验和响应面分析法，研究了各自变量交互作用及其对花青素提取量的影响，模拟得到二次多项式回归方程的预测模型。最佳提取工艺条件为：乙醇体积分数59.01%、液料比21.87：1(m L/g)、提取温度62.40 0C、提取时间2.76 h、pH 1.82。在此条件下，花青素的提取实测结果(103.48 μg/g)与响应曲面拟合所得方程的预测值(105.93 μg/g)符合良好。

关键词黑青稞；囊谦；花青素；响应曲面法；提取工艺

  青稞（Hulless barley）又称裸大麦，是青藏高原地区具有民族特色的粮食作物。囊谦县地处我国青海省玉树州最南端，有“玉树小江南”的美誉，黑青稞是主要的农产品资源，其特色品种“囊谦黑青稞”，种植历史悠久，全程不施农药，符合天然、绿色、健康的消费理念。

  黑色食品越来越受到人们的青睐，花青素是黑色食品重要的功能成分。花青素是一类广泛存在于植物中的水溶性天然色素，属黄酮类化合物，多以糖苷的形式存在，也称花色苷。黑青稞花青素属于水溶性花色苷类，安全无毒。此外，花色素具有较强的消除体内自由基和抗氧化作用，具有延缓衰老、增强免疫力、益气补肾、保护心血管等功能。因此，黑青稞花色素极具开发应用前景，对其提取工艺的研究具有重要的经济价值。

  采用响应曲面分析法，对“囊谦黑青稞”花青素提取工艺进行优化，获得最优工艺参数，旨在为黑青稞的综合开发利用提供一定理论参考。

1  材料与方法

1.1材料

  黑青稞样品为囊谦县特色品种“囊谦黑青稞”。

  无水乙醇、浓盐酸、氯化钾、醋酸钠，均为分析纯。

1.2仪器与设备

  pH计PHS-2C：上海三信仪表厂；数显恒温水浴锅HH-3A:国华电器有限公司；电子天平AL104:梅特勒-托利多仪器有限公司；721型分光光度计UNICO-JV2000;高速离心机5804R: Eppendorf仪器有限公司；旋转蒸发仪IKA-RV10:德国艾卡公司；循环水式多用真空泵SHB-III:郑州长城科工贸有限公司。

1.3方法

1.3.1黑青稞中花青素提取量的测定

  称取1g的囊谦黑青稞，在一定的条件下用酸性乙醇浸提，提取液经旋转蒸发仪浓缩至2 m L，然后分别用pH 1.0的氯化钾-盐酸缓冲液、pH 4.5的醋酸钠-盐酸缓冲液稀释，平衡1h后，采用pH示差法测定黑青稞中花青素提取量。

  式中：A-吸光度；ε——矢车菊花素-3-葡萄糖苷的消光系数，26 900; L-----光程，取1 cm,

Mw-----矢车菊花素-3-葡萄糖苷的相对分子质量，449.2：DF-----稀释倍数；V------待测花青素样品储备液体积，m L; m-干燥后黑青稞质量，g。

  以蒸馏水作对照，用A700nm来消除提取液干扰物质的影响。

1.3.2黑青稞花青素提取单因素试验

  分别考察乙醇体积分数、液料比、提取温度、提取时间和pH五个因素对黑青稞花青素提取量的影响，每个试验平行3次。

1.3.2.1  乙醇体积分数

  称取6份1g黑青稞粉，分别以10 m L的40%，50%, 60%，70%，80%和90%的乙醇水溶液于40℃ 水浴中提取1h，将提取液离心，取其上清液，测定花青素的提取量。

1.3.2.2液料比

  称取5份1g黑青稞粉，分别用5，10，15，20和25 m L 60%的乙醇水溶液在40℃水浴中提取1h，将提取液离心，取其上清液，测定花青素的提取量。

1.3.2.3提取温度

  称取6份1g黑青稞粉，分别用10 m L 60%的乙醇水溶液在40℃，50℃，60℃，70 ℃，80℃ 和90 ℃水浴中提取1h，将提取液离心，取其上清液，测定花青素的提取量。

1.3.2.4提取时间

  称取5份1g黑青稞粉，分别用10 m L 60%的乙醇水溶液在40℃ 水浴中分别提取0.5，1，2，3和4h提取1次，将提取液离心，取其上清液，测定花青素的提取量。

1.3.2.5 pH

  称取5份1 g黑青稞粉，分别用10 m L pH为1，2.3，4和5的60%乙醇溶液在温度为40 ℃水浴中提取1b，将提取液离心，取其上清液，测定花青素的提取量。

1.3.3响应面分析法优化工艺条件

  根据Box-Behnken的中心组合试验设计原理，基于单因素试验结果，以乙醇体积分数(A)、液料比(B)、提取温度(C)、提取时间(D)、pH (E)为五因素，黑青稞花青素提取量(Y)为响应值，采用五因素三水平的响应面分析法进行试验设计，因素水平设计如表1。

2结果与分析

2.1单因素试验结果与分析

2.1.1  乙醇体积分数对花青素提取量的影响

  由图1 (A)可见，随乙醇体积分数的增加，黑青稞花青素提取量呈先升后降趋势，60%时达峰值。当在乙醇体积分数较低时，可能因淀粉和其它水溶性物质溶解性好，影响了花青素的溶出，导致提取量较低；而当乙醇体积分数过高时，可能促使脂溶性物质容易溶出，降低了花青素的提取量。因此试验中乙醇体积分数范围定为50%~70%。

2.1.2液料比对花青素提取量的影响

  如图1(B)所示，随料液比增加，花青素提取量呈先升后降趋势，20：1（m L/g）时达到峰值。液料比是影响提取量的重要因素，液料比越小，两相间的浓度差越小，传质推动力就越小。其次，液料比大小会影响两相的混合情况。提高液料比能增大传质推动力，但杂质的提取量也随之升高，从而降低了花青素的提取量，并会造成大量溶剂的浪费和浓缩成本的升高。试验中液料比考察范围定为15：1～25：1 ( m L/g)。

  2.1.3提取温度对花青素提取量的影响

  随温度升高，花青素提取量呈先升后降趋势，60℃时达峰值，如图1(C)。结果表明在一定范围内升高温度有利于花青素的提取，但继续升高温度就会导致提取量下降，可能因为高温易导致花青素被氧化、结构破坏。试验将提取温度的范围定为50℃～70℃。

2.1.4提取时间对花青素提取量的影响

  随提取时间延长，花青素提取量呈先升后降趋势，在2h时达峰值，如图1(D)。时间超过2h后，高温会破坏花青素的结构，导致提取量下降。故将提取时间的考察范围定为1～3 h。

2.1.5 pH对花青素提取量的影响

  花青素在酸性条件下稳定且呈色效果好，因此采用酸性条件进行提取。如图1(E)所示，由随着pH增大，花青素提取量呈先增加后减少的趋势，pH 2时达峰值。pH过低可能使花青素的糖基水解，也会导致花青素的稳定性下降，而高pH可能将花青素裂解为花色素基元及糖基两部分，导致花色素结构不稳定；故试验将pH考察范围定为1.5～2.5。

2.2黑青稞花青素提取工艺的优化

2.2.1数学模型的建立

  基于单因素试验，根据Box-Behnken中心组合试验原理和响应面法对黑青稞花青素提取工艺进行优化。试验结果如表2所示，用Design Expert V 7.0软件对试验数据进行多元回归拟合，得到以黑青稞花青素提取量为目标函数，关于各条件编码值的二次回归方程为：

  Y=9 5.21- 3.49A+4.17 B+4.34 C+4.61D -12.13

E+7.93 BE-5.02DE-22.5 7A2-4.06B2-5.82C2-4.72D2-19.61E2

2.2.2方差分析

  模型的可靠性可从方差分析及相关系数来考察，如表3所示。模型p<0.000 1，表明试验所选用的二次多项模型极显著，且回归方程的决定系数为96.830/0，即96.83%的数据可用该模型解释。失拟值不显著，表明回归方程对试验数据拟合度高，可用此模型对试验响应值进行分析预测。

  二次多项模型中回归系数的显著性检验(见表3)表明，因素A、B、C、D和E对提取量的线性效应极显著，影响因素从大到小的顺序为：pH>提取时间>提取温度>液料比>乙醇体积分数；因素A2、C2、D2和E2对提取量的曲面效应极显著，因素B2对提取量的曲面效应显著；BE和DE对提取量的交互影响显著。五个因素均不同程度的对响应值产生显著或极显著的影响，表明试验设计的因素选择是成功的。

2.2.3  响应面分析

  响应面图是响应值对各试验因素所构成的三维空间曲面图，可直观反应各试验因素的交互作用。由表3所知，BE和DE对提取量的交互影响显著，如图2所示，液料比(B)和pH (E)对花青素提取量极显著，提取时间(D)和pH (E)对花青素提取量显著，表现为曲面较陡，随着这三个因素的增大或减小，响应值变化较大，而且pH (E)对花青素提取量的影响较液料比和提取时间更显著。

2.2.4确定最优条件及验证试验

  经Design Expert V7.0软件优化，囊谦黑青稞花青素的最佳提取工艺条件为：乙醇体积分数59.01%，液料比21.87：1(m L/g)，提取温度62.40℃，提取时间2.76 h，pH 1.82，理论计算花青素的最大提取量可达105.93μg /g。在此条件下进行验证试验，实测提取量为103.48 μg /g，误差量仅为1.80%。该值与数学模型优化得到的理论值相近，表示该模型对黑青稞花青素的提取工艺优化具有一定的实际应用价值。

3结论

  利用乙醇为提取溶剂，采用响应面法对“囊谦黑青稞”花青素提取工艺进行优化，得到五因素及其交互作用对花青素提取量的影响，确定各因素和响应值关系表达式。

  1)花青素提取量(Y)对乙醇体积分数(A)、液料比(B)、提取温度(C)、提取时间(D)、pH (E)的二次多项回归方程模型：Y=95.21-3.49 A+4.17 B+4.34 C+4.61 D-12.13 E+7.93 BE-5.02 DE-22.57 A2-4.06 B2-5.82 C2-4.72 D2-19.61 E2。该模型在试验范围内可以较准确预测黑青稞花青素的提取量。

  2)影响花青素提取量的各因素中，其作用大小依次为：pH>提取时间>提取温度>液料比>乙醇体积分数。

  3)黑青稞花青素的最佳提取工艺条件为：乙醇体积分数59.01%，液料比21.87：1（m L/g），提取温度62.40℃，提取时间2.76 h和pH 1.82，在此条件下花青素的实测提取量为103.48μg /g。