响应面法优化西洋参多糖的酶解辅助提取工艺

  吴宪玲，于晓红，刘涛，窦博鑫，刘颖

  哈尔滨商业大学食品工程学院(哈尔滨150076)

摘要  为研究西洋参中多糖的提取工艺条件，以西洋参为原料，利用纤维素酶和木瓜蛋白酶对其进行酶解，采用酶解辅助提取西洋参多糖，以酶解温度、酶解时间、pH、复合酶添加量、复合酶配比等对酶解辅助提取法进行单因素试验，初步确定各因素的最佳范围。在单因素试验基础上，采用响应曲面试验设计确定酶解辅助提取最佳条件。经试验得到，最优工艺参数为：酶解时间1.37 h、酶解温度60.20℃、pH 6.50、酶添加量1.44%，此条件下多糖得率为13.77%。酶解辅助提取方法简单、效率高，可作为西洋参多糖的提取工艺。

关键词西洋参；多糖；酶法提取；响应面法

  西洋参(Panax quinquefoliumL．或AmericanGin。eng)又名花旗参、美国人参、广东人参，原产于美国、加拿大等地，我国在20世纪80年代起大面积引种西洋参，目前种植主要集中在吉林，黑龙江、山东、北京等地。西洋参具有广泛的生物活性和独特的药理作用。现代医学研究表明西洋参具有提高机体免疫力、抗肿瘤、抗疲劳、防辐射和降血糖等作用。西洋参多糖是其发挥生物学作用的功效成分，具有重要的研究和开发应用价值。西洋参多糖不仅能增强机体网状内皮系统的吞噬功能，还能增加机体的非特异性免疫和细胞免疫功能。

  关于多糖的提取方法的报道很多，传统的提取方法有热水浸提法、水提醇沉法、稀酸法、稀碱法，其中常用的是热水浸提法。此外，酶解技术、微波技术、超滤法、超声辅助提取技术、超临界流体萃取技术也是近年来广泛应用到多糖提取的有效手段。应用热水提取西洋参多糖，醇分级沉淀法分离得到两个水溶性西洋参多糖组分，分别为粗多糖I、Ⅱ。应用多糖、皂甙联合提取法，从西洋参根中提取出西洋参多糖( PPQ)。通过乙醇分级分离、Sephadex凝胶过滤多次分离，得到4个西洋参活性多糖(PPQI-1～4)。酶法浸提是通过酶反应将原料组织分解，从而释放和提取目标提取物。西洋参植物细胞壁的主要成分为纤维素、半纤维素，纤维素酶则能特异性地降解纤维素，使植物细胞的细胞壁破裂，多糖易从胞内释放。蛋白酶对植物细胞中游离的蛋白质具有分解作用，使其结构变得松散；蛋白酶还会使糖蛋白和蛋白聚糖中游离的蛋白质水解，降低它们对原料的结合力，有利于多糖的浸出。其中木瓜蛋白酶是一种在酸性、中性、碱性环境下均能分解蛋白质的蛋白酶，具有较宽的底物特异性。因而试验选择木瓜蛋白酶与纤维素酶复合酶制剂辅助提取西洋参多糖。

  采用响应面法优化酶解辅助提取西洋参多糖的工艺参数，旨在为西洋参的深入研究及产业化开发提供一定的参考。1  材料与方法

1.1材料与仪器

  西洋参，吉林省；木瓜蛋白酶：北京索来宝科技有限公司；纤维素酶：上海蓝季科技发展有限公司；95%乙醇、重蒸苯酚、浓硫酸、标准葡萄糖等（均为国产分析纯）：成都市科龙化工试剂厂；试验用水均为蒸馏水。

  粉碎机：天津市泰斯特仪器有限公司；DHG-9203A型电热恒温鼓风干燥箱：上海恒科学仪器有限公司；BS224S电子天平：赛多利斯科学仪器有限公司；SY-2-4电热恒温水浴锅：天津欧诺仪器代表有限公司；TDL-5-A离心机：上海安亭科学仪器厂：RE52-99旋转蒸发器：上海亚荣生化仪器厂；SHB-Ⅲ循环水多用真空泵：菏泽市鑫源仪器仪表有限公司；PHS-3C精密pH计：上海雷磁仪器厂；Spectrum722E型紫外可见分光光度计：上海光谱仪器有限公司。

1.2试验方法

1.2.1标准曲线昀制作

  葡萄糖标准溶液的配置：精密称取106℃干燥至恒重的无水葡萄糖0.01 g，定容至100 L，得葡萄糖(G)标准溶液0.1 mg/L。备用。

  分别吸取0，0.1，0.2，0.4，0.6，0.8，1.0和1.2mL，每个做三个平行样。分别用蒸馏水补至2 L，即得相应浓度0，0.005，0.01，0.02，0.03，0.04，0.05和0.06 mg/L。加入6%苯酚溶液1mL，迅速加入5 L浓硫酸混匀，室温静置20 min，待溶液颜色稳定后，490 nm测定吸光度，以葡萄糖浓度(mg/L)为横坐标，吸光度A为纵坐标，做出苯酚-硫酸法标准曲线。确定吸光度(A)与总糖浓度(Cs)的关系。采用浓硫酸-苯酚法，绘制标准曲线，如图1所示。

1.2.2西洋参多糖得率的测定

  分别吸取1mL的待测样品液3份于试管中，均以蒸馏水补至2 m L，加入6%苯酚溶液1 m L，混匀，然后加浓硫酸5 m L，充分混合，放置20 min。按试验方法测定吸光度，根据所得回归方程，计算出多锫浓度，取其平均值，计算多糖得率。计算如式

  (1)  ：

  多糖得率=C x N x V/M x 100%  (1)

  式中：C--根据标准曲线测出的样液中的多糖浓度，mg/m L；N-样液的稀释倍数；V-提取液的总体积，m L;M一一西洋参的质量，mg。

1.2.3酶辅助水提醇沉西洋参多糖的方法

  将脱脂后西洋参样品1 g，加入25 m L蒸馏水配成西洋参溶液。将溶液pH调到5.5，添加酶底质量比为1%的复合酶制剂（纤维素酶与木瓜蛋白酶的质量比为1：1），在50℃恒温振荡器上酶解1h。酶解后的样品在100℃下水浴回流2h，离心，收集滤液，滤渣重复提取1次，合并滤液。滤液置于旋转蒸发仪中70℃～80℃减压浓缩直至黏稠。在冷却后的浓缩液中加乙醇，使其最终体积分数达到80%，静置过夜沉淀。离心，收集沉淀。最后用蒸馏水溶解沉淀，定容到50 m L，从50 m L中取5 m L定容到250 m L，摇匀，即为供试液。苯酚硫酸法测定吸光度，根据标准曲线算出多糖浓度，计算多糖得率。

1.2.4单因素对西洋参多糖得率的影响

1.2.4.1  复合酶比例对西洋参多糖得率的影响

  采用的复合酶比例分别为1:1，1：2，1：3，1:4和1：5。在基本工艺的提取条件下进行复合酶比例的选择。

1.2.4.2酶添加量对西洋参多糖得率的影响

  采用的酶添加量分别为0.5 %，1.0%，1.5%，2.0%，2.5 %和3.0%。在基本工艺的提取条件下进行酶添加量的选择。

1.2.4.3酶解温度对西洋参多糖得率的影响

  采用的酶解温度分别为40℃，45℃，50℃，55℃．60℃和65℃。在基本工艺的提取条件下进行酶解温度的选择。

1.2.4.4酶解时间对西洋参多糖得率的影响

  采用的浸提时间分别为0.5，1.0，1.5，2.0，2.5和3.0 h。在基本工艺的提取条件下进行酶解时间的选择。

1.2.4.5 pH对西洋参多糖得率的影响

  采用的pH分别为4.5，5.0，5.5，6.0，6.5和7.0。在基本工艺的提取条件下进行pH的选择。

1.2.5酶辅助提取西洋参多糖的响应曲面优化设计

  采用Design-Expert 7.0试验设计及统计分析软件中的Box-Behnken程序，根据单因素试验确定酶解时间、酶解温度、酶添加量和pH为酶辅助提取西洋参多糖试验的主要考察因素，分别以X1、X2、X3及X4表示。设计西洋参多糖酶解液的响应曲面试验，因素水平编码见表1。

1.2.6数据处理

  采用Design-Expert 7.0进行试验设计和数据处理，所有试验数据均进行3次重复。

2结果与讨论

2.1  西洋参多糖得率单因素试验结果分析

2.1.1复合酶配比对西洋参多糖得率的影响

  由图2可以看出，当复合酶配比即纤维素酶与木瓜蛋白酶比例为1：1～1：4时，多糖的得率随着复合酶配比中木瓜蛋白酶比例的增大而不断增加，当复合酶配配比为1：4时，西洋参多糖得率最大，多糖得率最高为13.45%。此后，多糖的得率反而有所下降。因此试验中纤维素酶与木瓜蛋白酶的复合酶配比定为1:4。

2.1.2复合酶添加量对西洋参多糖得率的影响

  由图3可以看出，当酶用添加量为0.5%~1.0%时，西洋参多糖的得率随着酶添加量的增加而不断增大，多糖得率的增幅最大，当酶添加量为1.0%时，西洋参多糖得率最高为12.98%。此后再增加酶添加量，多糖的得率反而有所下降。这是因为随着酶添加量的增大，酶与底物接触的机会增加，致使多糖更快地分离出来。当酶添加量达到一定程度，酶分子已经饱和，一部分酶分子没有机会与底物结合，底物被水解的速度降低，进而影响多糖的得率。因此选择1.0%为较优酶添加量。目前生物酶制剂价格较高，酶添加量直接决定西洋参多糖生产成本的高低，因此需采用响应曲面试验对酶用量进一步筛选。

2.1.3复合酶解温度对西洋参多糖得率的影响

  由图4可以看出，酶解温度为40℃～60 ℃，随着温度的升高，西洋参多糖的得率不断增加，当酶解温度为60 ℃时，西洋参多糖得率达到最大值，多糖得率最高为13.20%。而当温度继续升高时，多糖的得率开始下降。这是因为在酶催化反应中，随着温度的升高，反应物的能量增加，使反应速度加快，超过其最适温度后酶的活力降低，甚至完全丧失活力。同时，反应速度也会随温度升高而迅速下降，因此选择60  ℃为较优酶解温度。由图显示，酶解温度在55℃～65 ℃范围内其活性最大，综合考虑，进行响应曲面试验以确定酶解温度。

2.1.4  复合酶解时间对西洋参多糖得率的影响

  由图5可知，酶解时间为0.5～1.0 h时，多糖得率随酶解时间的延长有所升高，当反应时间为1.0 h时，西洋参多糖得率达最大值，多糖得率最高为12.97%，而1.0 h以后，随着酶解时间的继续延长，多糖得率有所下降。因为当酶解时间太短时，酶解不充分；当酶解时间为1h时酶解最充分；而随着酶解时间的继续延长，可能是因为时间过长，导致多糖分解或结构变化，多糖得率反而开始下降。因此选择1.0 h为较优酶解时间。综合考虑，进行响应曲面试验以确定酶解时间；

2.1.5 pH对西洋参多糖得率的影响

  由图6可知，当pH为4.5～6.0时，多糖的得率随pH的增加而有所升高，当pH 6.0时，西洋参多糖得率达到最大值，多糖得率最高为13.06%。此后随着pH增加，多糖得率开始有所下降。这是因为pH范围为4.5～6.0时，酶的活力渐渐增大，酶解越来越充分，在pH 6.0时，酶的活力最大，酶解最充分，多糖得率最大；而此后随着pH的逐渐增大，溶液就会出现过碱的情况，导致酶活力的降低，影响了酶与底物的亲和力，破坏了酶的活性，从而造成了多糖得率的下降。因此选择pH 6.0为较优酶解pH。综合考虑，进行响应曲面试验以确定酶解pH。

2.2酶辅助提取西洋参多糖的响应曲面优化设计结果分析

2.2.1  响应曲面试验结果

  响应曲面试验结果见表2。以回归系数建立多糖得率（R1）与酶解时间X1、酶解温度X2、酶添加量X、pH五的响应面回归方程为：

  R1=13.67+0.097 A+0.11B+0.27 C+0.075 D-0.023AB+0.15 AC-0.022 AD+0.13 BC-0.085 BD+0.13 CD-0.20 A2-0.29 B2-0.48 C2-0.11 D2，该方程包括了参数估计得出的所有各项，未去除不显著的因素。

  由表3方差分析可知，此模型的失拟项p=0.126 1>0.05，模型失拟项不显著，说明模型选择合适。模型的回归项p< 0.000 1，说明二次响应面回归模型是极显著的，表明所选用的二次回归模型是适当的，回归方程的总回归系数相关系数R2Adj=0.907 3、R2=0.953 7，说明该模型能反映95%响应值的变化，因而该模型拟合程度较好，试验误差较小，模型成立。所以，可以使用该模型来分析响应值的变化。从表3中可以看出，四因素及四因素的平方项都是显著的，一次项的回归系数绝对值的大小依次为：X3>X2>X1> X4，即影响西洋参多糖得率的因素的顺序依次为：酶添加量>酶解温度>酶解时间>pH，其中酶用量对西洋参多糖得率影响最大，呈极显著影响，pH对西洋参多糖得率影响最小，酶解时间和酶解温度，都有显著影响。

  采用Design-Expert 7.0软件对试验模型进行响应值优化分析，获得西洋参多糖的最佳提取条件为：酶解时间1.37 h、酶解温度60.20℃、pH 6.50、酶添加量1.44 %，此条件下多糖得率为13.77%。说明运用响应面优化得到的模型参数准确可靠。

2.2.2因素交互作用响应面分析

  结合二次回归方程及表3可知，二次项X1X3、X2X3、X3X4，具有显著的交互作用(p<0.05)，

X1X2、X1X4、X2X4不显著。通过立体响应面和等高线图可解释说明试验中自变量和因变量的关系，如图7所示。

  在四个显著影响因素的响应面中，从图7a中可以看出，酶添加量对应的曲线比酶解时间对应的曲线陡峭，这表明酶添加量对西洋参多糖得率的影响比酶解时间显著；从图7b中可以看出，酶添加量对西洋参多糖得率的影响比酶解温度显著；依次比较后得出影响西洋参多糖得率的因素的顺序，依次为X3> X2> X1>X4，即：酶添加量>酶解温度>酶解时间>pH，与方差分析表所得的分析结果一致。从图7a中可以看出，当酶解时间不变时，随着酶添加量的增加西洋参多糖得率出现先升高后降低的趋势，由此可见，酶解时间和酶添加量对西洋参多糖得率的交互影响存在极大值。比较酶解时间、酶解温度、酶添加量和pH这四个因素中每两个因素的交互作用，对西洋参多糖得率的影响结果，均升高后降低，响应值呈抛物线形趋势，因此回归方程有极大值。从图7中可以看出，各因素的交互作用对多糖得率的影响由强到弱依次为X1X3、X2X3、X3X4。分析与方差分析表分析得出的结论一致。采用最优工艺重复试验3次并计算平均值，此条件下得到的西洋参多糖得率为13.73%，与理论预测值13.77%相比，其相对误差为0.29%，说明该模型可以较好的模拟和预测西洋参多糖得率，拟合情况良好，达到设计要求。

3结论

  试验对酶解辅助提取西洋参多糖的条件进行了优化，以酶解温度、酶解时间、pH、复合酶添加量、复合酶配比等对酶辅助提取法进行单因素试验，初步确定各因素的最佳范围。在单因素试验基础上，采用响应曲面试验设计确定酶解辅助提取最佳条件。得到其最佳提取工艺为：酶解时间1.37 h、酶解温度60.20 0C、pH 6.50、酶添加量1.44%，此条件下多糖得率为13.77%。使用优化的方法可以提高西洋参多糖的得率，为西洋参多糖提取的工业化生产提供理论参考依据。