一种平颏海蛇酶解液脱腥去苦新 工艺

  作者：张毅         

  海蛇具有祛风除湿、舒筋活络的功效。水解动物蛋白( Hydrolysis animal protein，HAP)不仅具有动物蛋白风味，还保留了原料的营养成分；其主要以低分子量的短肽和氨基酸为主，易于人体消化、吸收，还具有广泛生物活性。其中海洋生物活性肽( Marine bioactive peptides)是当前的研究热点，研究者们已经从海洋动物中获得了许多具有抗氧化、降压、抗凝血、增强机体免疫等保健功能的蛋白水解物。

  试验研究发现海蛇枯草杆菌中性蛋白酶解液、碱性蛋白酶解液、木瓜蛋白酶解液、胰蛋白酶解液均有较好地清除DPPH自由基能力，但海蛇酶解液的腥苦味影响海蛇产品的进一步开发，故研究海蛇酶解液的脱腥去苦工艺极为重要。试验先采用风味酶、碱性蛋白酶、枯草杆菌中性蛋白酶、木瓜蛋白酶和胰蛋白酶对海蛇进行酶解，比较筛选出腥苦味最小的酶解液；然后比较活性炭吸附、酵母发酵和β一环糊精包埋对该酶解液脱腥去苦效果，再通过单因素试验及正交试验优选酶解液的脱腥去苦工艺，以期为海蛇蛋白酶解物在食品领域及医药领域的应用提供理论依据。

1  材料与方法

1.1材料、仪器与设备

  平颏海蛇干体；市售，经海南大学邓世明教授鉴定为平颏海蛇，凭证标本保存于海南大学海洋学院403室；BCA总蛋白试剂盒：北京艾德莱生物科技有限公司；木瓜蛋白酶：BR，上海金穗生物科技有限公司；枯草杆菌中性蛋白酶、碱性蛋白酶、风味酶：BR，北京索莱宝科技有限公司；胰蛋白酶：BR，国药集团化学试剂有限公司；高活性干酵母：安琪酵母股份有限公司；活性炭、β一环糊精：AR，广州化学试剂厂；磷酸盐缓冲液。

  F50酶标仪：瑞士Tecan；移液枪：eppendorf;ML204/02电子天平：梅特勒一托利多仪器（上海）有限公司；TDL-80-2B离心机：上海安亭科学仪器厂；PHS-3C pH计：上海精密科学仪器有限公司；CHA-C气浴恒温振荡器：金坛市大地自动化仪器厂。

1.2试验方法

1.2.1  腥苦味及工艺评分方法

  腥苦味通过感官评分。将10.0 mg/m L酶解液的腥苦味定为0，将其分别稀释成3.0，1.0，0.3，0.1和0.05 mg/m L 5个不同浓度，其腥苦味感官分数分别定为0.20，0.40，0.60，0.80和1.00分。由6人评定小组对海蛇酶解液先闻后尝，进行感官评价（分数越高，表示口感越好），结果记为6人所给出的平均分数。

  脱腥去苦工艺会造成一些小分子蛋白的损失，故脱腥去苦工艺评价采用腥苦味感官分数与蛋白回收率来综合评定：评定分数=感官分数×0.6+蛋白回收率×0.4。

  采用BCA总蛋白定量测试盒测定蛋白含量，计算蛋白回收率。将5.0 mg/m L的牛血清白蛋白( BSA)标准溶液稀释为4.0，3.0，2.0和1.0 mg/m L的浓度梯度，按BCA总蛋白定量测试盒操作，使用酶标仪在562 nm下测定吸光度，绘制BSA吸光度与浓度标准曲线，采用Spss17.0拟合线性回归方程，y=0.096 7x-0.002 7，r=0.998。测定脱腥去苦处理前后蛋白酶解

液的吸光度，根据线性方程计算蛋白浓度及蛋白回收率。每个样品平行操作3次，取平均值。

1.2.2多种酶解液的腥苦味比较

  以海蛇干体为原材料，分别用风味酶、碱性蛋白酶、枯草杆菌中性蛋白酶、木瓜蛋白酶和胰蛋白酶对海蛇进行酶解，酶解完毕立即煮沸15 min使酶失活，冷却至室温，离心取上清液得海蛇酶解液，酶解液冷冻干燥得海蛇水解动物蛋白。对以上5种酶解液进行感官评价及测定蛋白回收率。结果表明，海蛇木瓜蛋白酶解液腥苦味最小，蛋白回收率较高，故采用海蛇木瓜蛋白酶解液做后续试验。

1.2.3木瓜蛋白酶酶解液脱腥去苦

1.2.3.1  活性炭吸附法

  在100 m L海蛇木瓜蛋白酶解液(10 mg/m L)中添加0.5%的活性炭，pH 5.0条件下，40℃吸附1.0 h。冷却至室温，4 000 r/min离心，取上清液，进行感官评定，测定蛋白回收率，计算评定分数。

1.2.3.2酵母发酵法

  在100 m L海蛇木瓜蛋白酶解液(10 mg/m L)中添加1.0 %的酵母，30℃发酵1.0 h。高温灭菌，冷却至室温，4 000 r/min离心，取上清液，进行感官评定，测定蛋白回收率，计算评定分数。

1.2.3.3伊环糊精包埋法

  在100 m L海蛇木瓜蛋白酶解液(10 mg/m L)中添加4.0%的β环糊精，50℃ 磁力搅拌1.0 h，冷却至室温，4 000 r/min离心，取上清液，进行感官评定，测定蛋白回收率，计算评定分数。

  结果表明，活性炭吸附法对木瓜蛋白酶酶解液脱腥去苦效果最好。

1.2.4活性炭脱腥去苦单因素试验

1.2.4.1活性炭用量对脱腥去苦的影响

  分别在pH 5.0的海蛇木瓜蛋白酶解液(10 mg/m L)中添加0.2%，0.4%，0.6%，0.8%和1.0%的活性炭，40℃吸附1.0 h。4 000 r/min离心，取上清液，进行感官评定，测定蛋白回收率，计算评定分数。

1.2.4.2 pH对脱腥去苦的影响

  分别在pH 3.0，5.0，7.0，9.0和11.0的海蛇木瓜蛋白酶解液( 10 mg/m L)中添加0.4%的活性炭，40℃吸附1.0 h。4 000 r/min离心，取上清液，进行感官评定，测定蛋白回收率，计算评定分数。

1.2.4.3温度对脱腥去苦的影响

  pH 7.0的海蛇木瓜蛋白酶解液(10 mg/m L)中添加0.4%活性炭，分别在20℃，30℃，40℃．50℃和60℃吸附1.0 h。4 000 r/min离心，取上清液，进行感官评定，测定蛋白回收率，计算评定分数。

1.2.4.4时间对脱腥去苦的影响

  pH 7.0的海蛇木瓜蛋白酶解(10 mg/m L)中添加0.4%的活性炭，40℃条件下分别吸附0.5，1.0，2.0，3.0和4.0 h。4 000 r/min离心，取上清液，进行感官评定，测定蛋白回收率，计算评定分数。

1.2.5  活性炭脱腥去苦工艺正交优化

  以评定分数为指标，在单因素试验的基础上，进行L9(34)正交试验（参见表1），对活性炭最佳脱腥去苦工艺进行优化。

2结果与分析

2.1木瓜蛋白酶解液具有最小的腥苦味

  结果显示木瓜蛋白酶具有良好的去苦作用和一定的去腥作用，并且蛋白回收率较高，结果见表2。

故后续试验以木瓜蛋白酶酶解液为材料。

2.2活性炭吸附法对木瓜蛋白酶解液的腥苦味去除效果最好

  活性炭对海蛇木瓜蛋白酶酶解液脱腥去苦作用优于酵母和3-环糊精，结果见表3。活性炭由于其高度发达的孔隙结构和巨大的比表面积能快速吸附腥苦味物质，脱腥去苦效果显著，但蛋白回收率偏低。酵母对海蛇酶解液具有一定的脱腥去苦作用，与活性炭相比，蛋白回收率高；但酵母的添加使海蛇酶解液颜色加深，并引入酵母的异味。β一环糊精在50 0C水中溶解度约52.7 mg/m L，可能由于β一环糊精水中溶解度小及空腔不够大，不能包埋苦味肽导致其对海蛇酶解液脱腥去苦效果不理想。

2.3  活性炭脱腥去苦单因素试验结果

2.3.1  活性炭用量对脱腥去苦效果的影响

  由图2可知，随着活性炭用量增加，腥苦味减小，但蛋白回收率显著降低，当活性炭用量0.4%时评定分数最高。

2.3.2 pH对脱腥去苦效果的影响

  由图3可知，当pH为中性时酶解液的腥苦味明显小于酸性时，当溶液呈中性时，蛋白回收率最高，综合评定当pH 7.0时，脱腥去苦效果最好。

2.3.3温度对脱腥去苦效果的影响

  由图4可知，随着温度的升高，感官评定值缓慢升高，蛋白回收率缓慢降低，综合评定当温度为40℃时，脱腥去苦效果最好。

2.3.4时间对脱腥去苦效果的影响

  由图5可知，当活性炭吸附时间大于1 h后，随着时间延长腥苦味变化不大，但蛋白回收率显著下降，当活性炭吸附时间为1.0 h时，活性炭脱腥去苦效果最好。

2.4正交试验结果

  对试验结果进行直观分析，结果见表4。以评定分数为指标，最佳脱腥去苦条件为：A2B2C2D2，即在pH 7.0条件下，添加0.4%活性炭，40℃吸附1 h。在此条件下对500 m L海蛇木瓜蛋白酶解液脱腥去苦，海蛇酶解液呈淡黄色澄清液体，感官分数0.91，蛋白回收率0.825%．评定分数0.88。

3结论

  海蛇经木瓜蛋白酶水解所得酶解液腥苦味最小，活性炭吸附对海蛇木瓜蛋白酶解液脱腥去苦效果优于酵母发酵和β一环糊精包埋。海蛇脱腥去苦最佳工艺为：海蛇经木瓜蛋白酶水解后，在pH 7．0条件下，添加0.4%的活性炭40℃吸附1.0 h。

4摘要  海蛇酶解液具有较好的抗氧化活性，而其腥苦味限制海蛇蛋白产品的进一步开发。试验首先分别用风味酶、碱性蛋白酶、枯草杆菌中性蛋白酶、木瓜蛋白酶和胰蛋白酶对海蛇进行酶解，比较所得海蛇酶解液的腥苦味，从中筛选出腥苦味最小的海蛇酶解液；然后以腥苦味最小的海蛇酶解液为原料，比较活性炭吸附、酵母发酵和β一环糊精包埋对其脱腥去苦效果：再通过单因素试验及正交试验对脱腥去苦工艺进行优化，以期促进海蛇水解动物蛋白

在功能食品领域的进一步开发利用。试验发现海蛇经木瓜蛋白酶水解所得酶解液腥苦味最小，活性炭吸附对海蛇木瓜蛋白酶解液脱腥去苦效果优于酵母发酵和β一环糊精包埋。海蛇最佳脱腥去苦工艺为：经木瓜蛋白酶酶解，在pH7.0条件下，添加0.4%的活性炭于40℃吸附1.0 h。