作者：张毅
巴山冷杉枝叶中含有黄酮类、生物碱、有机酸、类和鞣质、糖及苷类、酚蒽醌等成分，具有广阔的开发应用前景。为了合理地利用巴山冷杉资源，试验进行了巴山冷杉黄酮提取、种类鉴定及抗氧化性初步研究。
1 材料与方法
1.1试验材料
1.1.1试验材料
巴山冷杉枝叶于2014年7月中旬采自陕西省太白林业局黄柏塬林场。将针叶阴干、粉碎、过10目筛装袋备用。
1.1.2仪器与设备
AUY220电子天平：苏州丰盛电子科技有限公司；FW200高速万能粉碎机：北京中兴伟业仪器有限公司；KQ-500VDE型数控超声波清洗器：昆山市超声仪器有限公司；UV-3100紫外一可见分光光度计：上海美谱达仪器有限公司；ZF-1三用紫外分析仪：天津科诺仪器设备有限公司。
1.2试验方法
1.2.1标准曲线的绘制
采用亚硝酸钠-硝酸铝显色法，以芦丁为标准品制作标准曲线，用Excel软件分析得回归方程为A=15.33C-0.008（C为芦丁质量浓度，mg/m L;A为吸光度），R2=0.999 3，线性范围为0～0.045 mg/m L。同样方法测定提取液中黄酮显色反应的吸光度，通过回归方程计算巴山冷杉中黄酮的含量。
1.2.2巴山冷杉黄酮提取方法
将针叶阴干，粉碎，过10目筛装袋备用。称取粉末0.5 g于锥形瓶中，加不同料液比的乙醇水溶液，在不同功率、不同温度下超声不同时间后，将提取液真空抽滤，收集滤液定容至50 m L。吸取滤液1 m L于25m L容量瓶中进行亚硝酸钠一硝酸铝显色反应，30 min后10 000 r/min下离心15 min，测定510 nm下上清液的吸光度。
1.2.3单因素试验
选择超声温度、超声功率、超声时间、乙醇体积分数和料液比5个因素进行单因素试验。各因素的水平梯度分别设置为：超声温度：25℃，35℃，45℃，55℃，65℃和75℃；超声功率：200，300，400和500 W;超声时间：20，30，40，50，60和70 min；乙醇体积分数：30%，40%，50%，60%，70%，80%和90%；料液比：1：10，1：20，1：30，1: 40和1：50( g/m L)。
1.2.4响应面试验设计
参照单因素试验结果，采用Design-Expert 8.06，Box-Benhnken( BBD)设计，确定料液比为1：20(g／m L)，以超声温度、超声功率、超声时间和乙醇体积分数4因素为自变量，以黄酮提取率为响应值，通过4因素3水平的响应面分析法对巴山冷杉黄酮的超声提取工艺进行优化，试验设计见表1。
1.2.5 巴山冷杉中黄酮类化合物的鉴别
利用颜色反应盐酸-镁法、草酸和浓硫酸法、四氢硼钠法、硝酸铝法以及氢氧化钠法，对提取液中黄酮类化合物种类进行鉴别。
1.2.6巴山冷杉黄酮抗氧化性测定
1.2.6.1 巴山冷杉黄酮对DPPH自由基清除能力的测定
参照Gurpreet Kaur( 2006)，反应体系改为2m L 0.1 mg/mL DPPH和2 m L样品，以槲皮素和VC作为标准物。清除率计算公式如下：
1.2.6.2 巴山冷杉黄酮对ABTS自由基清除能力的测定
参照Perumal Siddhuraju (2006)，稍加改动为反应体系100 VL待测液加3.9 m L预热至37℃的ABTS．+反应液，以VC和槲皮素作为标准物。清除率计算公式如下：
2结果与分析
2.1 单因素试验结果与分析
由图1可知，巴山冷杉中黄酮类化合物有两种形式：黄酮苷元和糖苷。当乙醇体积分数较低时，黄酮苷元的溶出量较低，糖苷的溶出量较多；当乙醇体积分数较高时，前者增加，后者减少。在50%～70%范围内，溶出的黄酮苷元和糖苷两种形式的黄酮类化合物总量不变，出现平台现象。从成本及能耗方面考虑，选择最佳乙醇体积分数为50%。
在65℃之前，黄酮提取率和温度成正比关系，达到峰值后趋于稳定。高温加强了黄酮的溶解和扩散，加快了其溶出的速度，但随着温度的继续增高，黄酮可能被氧化破坏，同时从能耗角度考虑，选择温度为65℃为宜。
在超声功率为200～300 W功率范围内，功率的增加加速了细胞壁的破裂和溶剂的渗入，黄酮提取率随之提高；当提取率在300 W达到最高值后，继续增加功率，提取率反而下降。这是由于此时气泡数量虽然增加但爆破冲击力减弱，致使空化作用减弱。同时过高的功率造成局部高温，可能对黄酮化合物结构造成破坏。因此，最适超声功率为300 W。
黄酮提取率与超声时间呈近抛物线变化规律。在20～40 min范围内，两者呈正比关系，提取率在40 min到达峰值后，两者又近似反比。因此，超声波提取以40 min为佳。
料液比为1：20( g/m L)时曲线达到峰值，说明1：20( g/m L)的料液比已足够溶解有效成分，继续增大料液比，提取率出现略微下降。综合成本考虑，选择1：20（g/m L）为最佳料液比。
2.2超声提取巴山冷杉针叶黄酮工艺优化
2.2.1 响应面分析方案及结果
采用响应面BBD试验设计及结果如表2所示。
利用软件Design-Expert 8.06对表2所示数据进行分析，得到黄酮提取率Y(%)与编码自变量A，B，C和D的回归方程为：Y=4.80+0.042A+0.015B+0.027C+0.059D— 0.013AB—0.041AC— 0.019AD — 7.25×10-3BC-0.022BD— 0.038CD —-0.12A2—0.084B2—0.12C2—0.055D2.
通过对表3和图2的分析可知，A，B，C和D四因素都是影响黄酮提取率的极显著因素(p<0.01)，影响程度依次为D>A>C>B，与单因素试验结果基本一致。4个因素的交互作用中，AC、AD、BD和CD的交互作用对提取率影响为极显著，其他交互作用均不显著。
表3结果表明，试验所用回归模型p< 0.01，为极显著；失拟项p=0.366 2，不显著；决定系数R2=0.992 3。综上所述，巴山冷杉黄酮的提取率用该模型进行分析和预测时，预测值和实际值误差不大，结果可信。
2.2.2最佳超声提取条件的确定及验证
通过软件分析得到，在试验范围内，巴山冷杉黄酮提取率最高可达4.821%，最佳提取条件为：乙醇体积分数55.18%，超声温度66.25℃，超声功率300.88W，超声时间40.10 min。在实际操作中，将工艺条件修正为：乙醇体积分数55%，超声温度66℃，超声功率300 W，超声时间40 min，进行3次重复试验，得黄酮提取率的实测值为4.817%，与理论预测值误差为0.004%，说明响应面法优化模型能较好的预测巴山冷杉中黄酮含量，所得工艺条件比较可靠。
2.3 巴山冷杉中黄酮类化合物的鉴别
表4结果显示：提取液中加入浓硫酸后变为橙色，盐酸一镁粉反应和四氢硼钠反应均显红色，证明提取液中有二氢黄酮存在；浸有提取液的滤条上喷施硝酸铝溶液和氢氧化钠溶液，在紫外灯下观察分别由黄绿色荧光和深黄色荧光，说明有黄酮醇；喷施草酸，紫外灯下观察有黄色荧光，说明有查尔酮。综上所述，巴山冷杉中含有二氢黄酮，黄酮醇类和查尔酮。
2.4 巴山冷杉黄酮抗氧化性测定
2.4.1 巴山冷杉黄酮对DPPH自由基清除能力的测定
由图3可知，对DPPH自由基的清除能力VC>槲皮素>巴山冷杉。样品浓度较低时，巴山冷杉黄酮清除DPPH自由基的能力略高于VC，近似于槲皮素。随着样品浓度的增加，清除率快速提高，当浓度达到30ug/m L时平缓上升，50 ug/m L时趋于稳定。经计算得
VC的半数抑制浓度(IC50) =13.34，槲皮素的IC50为11.37，巴山冷杉黄酮的IC50=18.99，由此可见，巴山冷杉黄酮对DPPH自由基有一定的清除能力。
2.4.2巴山冷杉黄酮对ABTS自由基清除能力的测定
如图4所示，巴山冷杉黄酮对ABTS．+的清除率约为86%。0~100 ug/m L范围内，增加样品浓度，提取液对清除ABTS．+的能力也逐渐增强。当样品浓度达到100ug /m L，清除率趋于稳定，且提取液的清除率小于VC和槲皮素。经计算得VC的IC50=11.76，槲皮素的IC50=12.13，巴山冷杉黄酮的IC50=27.70。
3结论与讨论
1)目前提取植物黄酮的主要方法有溶剂提取法，微波提取法，超声波提取法，酶解法，超临界流体萃取法等。应用超声波提取植物有效成分具有操作便捷，提取率高，时间短速度快等优点。通过响应面法分析超声波提取得到巴山冷杉针叶黄酮的最佳工艺为超声温度66℃，超声时间40 min，超声功率300 W，乙醇体积分数55%，在此条件下黄酮实际提取率达到4.817%。
2)目前从冷杉属植物中分离出的黄酮类物质共有24种，通过颜色反应，初步鉴定出巴山冷杉针叶中含有二氢黄酮、黄酮醇类、查尔酮等黄酮类化合物，然而作为我国特有树种，能否从巴山冷杉中分离出新物质还有待进一步探究。
3)黄酮是多数植物的主要抗氧化物质，对诸如炎症、动脉硬化、老年痴呆症、帕金森症等由活性氧引起的，自由基生成一清除体系不平衡导致的疾病具有缓解和修复等作用。其结构中B环上的3’，4’-0--羟基基团，C环上与4-酮基基团结合的2，3-双键以及3-羟基基团，B环上的3’，4’,5’一三羟基基团和拥有半个没食子酸结构对黄酮类物质抗氧化能力贡
献最大。试验表明，黄酮提取液对DPPH自由基，ABTS自由基均具有较好的清除作用，清除率分别为66.5%和86.8%。但是提取液中哪种结构成分对抗氧化能力贡献大有待更深层次的探究。
3摘要 以巴山冷杉针叶为原料，采用超声波法和比色法等研究黄酮类化合物的提取工艺与黄酮种类鉴别，并对其进行体外抗氧化能力测试。结果表明影响黄酮提取率大小的因素由大到小依次为：乙醇体积分数>超声温度>超声功率>超声时间。超声波法提取巴山冷杉针叶黄酮的最佳工艺条件为；乙醇体积分数55%、超声温度660C、超声功-300 W、超声时间40 min。在此条件下黄酮提取率可达4.817%。巴山冷杉针叶中的黄酮类物质主要为二氢黄酮、黄酮醇和查尔酮。巴山冷杉针叶黄酮提取液对DPPH自由基和ABTS自由基均具有较好的清除作用，清除率分别为66.5%和86.8%。
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