作者：张毅
随着研究的不断深入，人们对痕量，甚至超痕量样本的测定越来越多，这对ELISA的检测限提出了新的、更高的要求。另外，ELISA的影响因素较多，容易造成结果失真，时间和操作要求非常严格，对于阳性的区别比较模糊，有时候需要反复实验等。这些因素的存在都大大限制了其应用。
鉴于目前存在的局限性，我们在传统ELISA方法中引入了纳米金粒子(Au nanoparticles，AuNPs)和氧化石墨烯(graphene oxide，GO)。由于这两种材料都具有制备过程简单、比表面积大、易与蛋白质结合、能保持抗体生物活性等优点，在生物学领域得到了广泛应用。本研究旨在通过抗体功能化的AuNPs和CO的引入，逐级放大检测信号，以减低ELISA的检测限，扩大该方法的适用范围和领域。
1 材料与方法
1.1材料
谷胱甘肽S转移酶( csrr)、CST-Abl、HRP-Ab2（购自北京康为试剂公司）；聚二甲基氯化铵(PDDA，20%，Mr：200 000-350 000)、牛血清白蛋白(BSA)、1一乙基-3-（3-_甲基氨）一碳二亚胺盐酸盐(EDC)、2一（Ⅳ一吗啉）乙磺酸(MES)、Ⅳ一羟基琥珀酰亚胺(NHS)（购自Sigma-Aldrich公司）；石墨（美国AlfaAesar公司）；氯金酸（HAuC14-4H20，南京市威圣化工贸易有限公司）；柠檬酸钠（上海创顺化工有限公司）；KH2PO4、Na2HPO4、KCl、Tween-20（购白北京化学试剂公司）；实验用水为二次蒸馏水。
Milli-Q型密理博纯水仪（≥18 MQ，美国Milli-pore公司）；Tecnai G2 20型透射电镜（FEI香港有限公司）；PHI 5000C ESCA型X线光电子能谱仪（美国RBD公司）；85-2数显型恒温搅拌器（国瑞试验仪器厂）；SORVSLL型LEGEND MICR0 17Centrifrige（Therno公司）；Dimension V型原子力显微镜（美国Veeco公司）。
1.2 AuNPs与AuNPs-GST-Abl的制备
将I mL浓度为10 g/L的氯金酸溶液加入100mL双蒸水中，加热至沸腾，然后迅速加入2.5 mL浓度10 g/L的柠檬酸钠溶液，充分搅拌，保持沸腾15min。这期间溶液颜色依次由灰变蓝再变紫，最后为酒红色。移去热源，自然冷却至室温，即制得平均粒径为16 nm的金颗粒，4℃保存备用。纳米金在制备过程中，要保证所用玻璃器皿的绝对清洁，首先将所用器皿用干水（浓HNO2：浓HCI=l：3）浸泡过夜，然后用双蒸水冲洗3次，烘干待用。在加入柠檬酸钠后要充分搅拌，以免形成的纳米金颗粒聚集。在纳米金与抗体结合后，要用锡箔包裹避光保存，以避免该结合体见光解离，最好现用现配。
在制备AuNPs的基础上，将0.3 mg GST-Abl加入pH6.0的纳米金溶液中，室温下搅拌2 h；然后加入2 mL浓度为10 g/L的BSA溶液，室温封闭30min；13 300 r/min离心10 min，溶液分成上、下两层，上层为没有结合的抗体，下层为黑色、松软的结合物；除去上清，用含10 g/L BSA的PBS缓冲液( pH7.2-7.4)将产物(AuNPs-GST-Abl)洗涤并离心3次，最后溶于PBS中，置于4℃备用，该产物能在一个月内保持活性。
1.3 GO和GO-Ab2的制备
石墨烯，又称单层石墨或二维石墨，是单原子厚度的二维碳原子晶体，被认为是富勒烯、碳纳米管和石墨的基本结构单元。石墨烯因具有大的比表面积、突出的导热性能和力学性能及非凡的电子传递性能等一系列优异性质，被业内人士广泛关注。制备GO的方法很多，而将石墨氧化成氧化石墨，再在超声条件下得到单层的GO溶液，已成为GO制备的有效途径。具体步骤如下：首先将0.5 9石墨粉末和0.5 g硝酸钠加入23 mL预冷的浓硫酸中，搅拌反应10 min;然后缓慢加入4 9高锰酸钾，35℃反应1 h；再向反应体系中缓慢加入40 mL蒸馏水，95℃反应1 h，加入100 mL蒸馏水终止反应；然后加入2 mL浓度为30%的H2O2，室温反应2h，将产物离心，并用1 L的HCl(5%)洗涤，随后用4L蒸馏水洗涤，离心并再次洗涤；将得到的产物于40℃真空干燥48 h，即为GO粉末，置于4℃备用。
将50 mg NaOH和CICH2COONa加入1mL浓度为1 mg/mL的GO溶液中，超声波裂解1.5 h；将产物GO-GOOH用双蒸水洗涤3次，除去过量的碱；将400 mmol/L EDC和200 mmol/L NHS -起加入1mL MES缓冲液(pH6.0)中反应30 min;将混合物于13 300 r/min离心5 min，除去上清，此过程重复3次；将得到的GO-Ab2溶于含有10 g/L BSA的1.0mL PBS(pH7.4)中，置于4℃备用。
2结果和讨论
2.1 AuNPs与AuNPs-CST-Abl的表征
图1A为AuNPs的透射电镜网，图IB为AuNPs-GST-Ahl的透射电镜图。可以看出，AuNPs为黑色球状物，粒径为16 nm。AuNPs与GST的抗体结合后，形成包裹黑色AuNPs颗粒的絮状物。
2.2 GO与GO-Ab2的表征
图2A为GO的透射电镜图，图2B为GO-Ah2的透射电镜图，上面的黑色斑点为结合在GO片上的抗体。为保汪GO与二抗的结合率，又不破坏抗体的活性，在由石墨制备得到GO后，要用去离子水透析GO-COOH悬浮液48 h以上，以除去所有离子，因为杂质粒子的存在对GO与抗体的结合会产生非常不利的影响；然后将GO、EDC、NHS和MES缓冲液混合，反应30 min，此时加入的EDC要过量，因为EDC遇水迅速发生水解，量太少不能发挥缩合的作用。
2.3 ELISA应用
将抗体功能化的纳米金和GO用于ELISA试验。首先将GST附着在同相载体上，形成固相抗原，洗涤除去未结合的蛋白质及杂质；然后加GST-Abl与37C抚育2h，使抗体和GST结合形成抗原一抗体复合物；洗涤除去未结合物质；加入酶标抗体( HRP-Ab2)．37℃抚育1 h，使同相免疫复合物上的抗原与酶标抗体结合；洗涤未结合的酶标抗体；此时固相载体上带有的酶量与标本中受检抗原的量相关；最后加底物显色，同相上的酶催化底物成为有色产物；通过酶标仪读数，测知GST的量。ELISA方法的操作流程如图3所示。
在A路线中，每一个GST分子只能结合一个对应的一抗，而每个一抗也只能结合一个二抗和HRP；而在改进后的B路线中，每个GST分子与结合在纳米金颗粒上的多个（假定为x个，则x>l）一抗中的一个结合，而其余一抗又可以和GO上的二抗结合，通过GO的连接作用，每个二抗可以和多个（假定为y个，y>1）HRP形成结合体，通过纳米金和GO的2次串联放大作用，能够将较小的GST信号逐级放大，提高了检测的灵敏度。
为了考察改进后ELISA方法的性能，用抗体功能化的纳米金颗粒和GO对GST进行检测。在图4中，A和C行对应的GJST浓度和稀释方法（依次1/3梯度稀释）完全相同，其中A行使用AuNPs-Abl和℃-Ab2-HRPs．C行使用传统的Abl和Ab2-HRP，其余实验因素完全相同。结果表明，对抗体功能化修饰后，ELISA的检测限从1.62μg/mL降低至0.02μg/mL，检测能力扩大了81倍。所以，用纳米金和GO功能化修饰后的抗体分别代替传统抗体，可以有效地降低检测限。多次试验结果表明该方法稳定，重复性好，可对样本中低浓度蛋白质进行灵敏检测。
综上，通过AuNPs和GO对抗体进行功能化修饰，用于ELISA检测的双信号放大，提高了该方法的检测灵敏度，降低了检测限，提高了其对痕量样本的检测能力，扩大了应用范围。而且该方法重复性好，操作简便，具有很强的实用价值。可以预见，改进后的方法将会在蛋白质检测和诊断学研究中发挥应有的作用。
3[摘 要] 目的：在传统酶联免疫吸附测定法( ELISA)中引入纳米金和氧化石墨烯，以降低传统方法的检测限。方法：EI.ISA是根据抗原或抗体的固相化及抗原或抗体的酶标记对受检物质进行检测的一种有效方法：本研究在传统方法的基础上，将一抗和二抗分别与纳米金和氧化石墨烯结合，以提高ELISA对痕量样本的检测灵敏度，降低检测限。结果：优化后的方法可对0.02μg/ml.的谷胱甘肽S转移酶(GST)进行检测，灵敏度提高了81倍，动态范围为0.02-1.62μg/mL。结论：改进后的ELISA性能稳定，重复性好，可用于生物样本中痕量物质的测定。
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