关于普通小球藻规模化培养参数的探索

作者：张毅

目前，全球已有150多家专门从事微藻能源开发的公司，但迄今国内外尚无经济上可行的微藻能源生产系统。C02的减排已成为亟待解决的全球性问题，从持续发展的角度来看，微藻减排C02技术是符合自然界循环，同时能够节省能源的CO2减排方式。小球藻油脂量含量高，具有光合速率高、繁殖快、环境适应性强、处理效率高、可调控以及易与其它工程技术集成等优点，同时固碳后产生大量的藻体具有很好的利用价值，具有高度的工业化潜力。因此，小球藻规模化培养有望成为一种具有相当可行性和经济价值的C02固定方法，为人类解决能源、环境问题提供一条全新而有效的模式。

    微藻是一种能够利用太阳光吸收C0二产生生物质的有机体，其中的普通小球藻具有繁殖快、可利用废水废气和产油量高等特点，有望成为解决可再生能源生产和温室气体减排的有效方法之一，但其规模化的培养仍受多种因素的限制。影响普通小球藻生长的因素包括光质、pH、光强、温度、水、反应器结构、C02供应与溶解以及培养基组成等。本文以普通小球藻规模化培养为前提，研究了普通小球藻的最大吸收波长，并研究了溶解C02浓度对小球藻胞外碳酸酐酶活性的影响以及不同培养基组成、不同光生物反应器和pH对普通小球藻生长的影响，为普通小球藻的规模化培养提供操作参数的指导。

1材料与方法

1.1藻种

    普通小球藻（Chlorella vulgari.s），由中国科学院大学青岛生物能源与过程研究所保存。

1.2培养基

    (I)BGll培养基m:NaN03 I.5 g/L，CaCl2 - 2H2036 mg/I_,,Na2C03 20 mg/L,MgS04-7H20 75 mg/L,K2HP04 30.5 mg/L(K2HP04-3H20 40 mg/L)，柠檬酸6 mg/L，柠檬酸铁铵6 mg/L，EDTANa2 1 mg/L，微量金属离子溶液1mUL。微量金属离子溶液组成如下(g/L):H3803 2.86，MnCI2．4H20 1.81，ZriS04·7H20 0.22,Na2M004·2H20 0.39’CuS04.SH20 0.079,Co (N03)2-6H20 0.05。用NaOH和HC1调整pH至7.1（起始pH为8.5），121 0C灭菌15 min后备用。

    (2)DS培养基：(NH2)2C0 300 mg/L，KH2P04 50 mg/L,MgS04 300 mg/L,FeS04 8 mg/L,NaCl1 000 mg/L，NH。HC03 500 mg/L，其中，FeS04现用现配。

    (3)ND培养基c9l:KN03 1 000 mg/L，KH2P04 237 mg/L,CaCl2 -2H20 88 mg/L,EDTA 40 mg/L,

FeS04-7H20 30 mg/L, MgS04·7H20 204 mg/L，微量金属离子溶液1 mUL。微量金属离子溶液组成如下(g/L):H3803 0.83, (NH4)6M07024·4H20 0.17,CoCl2·6H20 0.51,MnCl2·4H20 3.3,CuS04·5H200.95，ZnS04 - 7H20  2.7。

1.3微藻培养方法

    装液量为三角瓶容积的80%，接种后的三角瓶放置于光照振荡培养箱中进行振荡培养，转速为150 r/min．光照强度为30 umol/(m2.S)，培养温度为25+1℃；柱式反应器直径为11 cm，高度为1m，装液量为8L，分别采用体积比为2:98和15:85的C02和N：的混合气曝气培养，气体流量为0.012 5m3／(m3.min)，光照强度为120 umol/(fm.S)，平板反应器长度和宽度均为1 m，厚度为5 cm．装液量为35 L，采用2%C02+98%N2混合气曝气培养，气体流量为0.025m3／(m3.min)，光照强度为120 umol/( (m.s)。以上均为连续光照培养，微藻母种由BG11培养基保存和培养。

1.4分析方法

    采用比浊法测量波长750 nm处的光密度值（以蒸馏水为空白对照）以表征小球藻生物量：采用C02电极测量C02的溶解浓度；pH漂移测定参考文献[9];碳酸酐酶活测定参考文献[10]。

2结果与分析

2.1普通小球藻特征吸收峰的研究

本实验研究了不同质量浓度下小球藻的全波长扫描图谱，实验结果如图1所示。由图1可知，不同浓度的小球藻溶液在450—500,650—700 nm和950—1 000 nm处有吸收峰。其中950～1 000 nm为不可见光，450～500 nm处有吸收峰说明小球藻含有类胡萝卜素，650—700 nm处的吸收峰主要是由叶绿素a和b吸收可见光导致的，因为叶绿素a和b的最大吸收峰分别为664.1 nm和648.6nm,650—700 nm可作为叶绿素特征峰的区间。微藻培养过程中由于生长条件的变化会导致微藻细胞内色素含量的变化，如果依据叶绿素吸收特征峰来确定微藻的干重和数量会存在较大误差，因此，选择偏离特征峰区间的750 m( OD750)作为测定光密度值的波长。此外，通过全波长扫描可知，小球藻对红光(630—780 nm)和蓝光(420—470nm)的利用效率高。

2.2普通小球藻种子培养最佳种龄的研究

    微藻生长过程一般分为延滞期，对数期，直线期，稳定期和衰亡期。处于对数期的微藻生命力旺盛，代谢能力强，常作为微藻培养的种子。小球藻规模化培养之前需要经过保藏藻种、一级扩大培养、二级扩大培养甚至三级扩大培养过程，目的是提供生命力旺盛并且足够数量的种子。本实验研究了普通小球藻在三角瓶，柱式反应器和平板反应器3种培养装置和不同培养基的生长过程，以确定各个培养装置转接微藻的最佳时期，即最佳种龄的确定。

三角瓶培养过程采用的培养基为DS培养基，其中HC03--为主要碳源，因此不需要充人C02曝气培养。柱式反应器和平板反应器研究了2种培养基对小球藻生长的影响，各培养装置中微藻的生长曲线如图2所示。对于三角瓶培养的小球藻，培养144 h后生长趋于缓慢，因此选择120～144 h为最佳种龄；在柱式反应器中．ND培养基更有利于小球藻的生长，并且体积分数为2%和15%的C02对小球藻的生长的影响效果基本相同，因此选择2%的C02作为碳源。对于平板反应器，小球藻在ND培养基中的生长速率明显高于DS培养基。因此，普通小球藻种子培养逐级扩大培养过程中，以三角瓶为一级扩培时，以DS为培养基，最佳种龄为120—144 h：以柱式光生物或者平板式光生物反应器作为二级扩培，或者以平板式光生物反应器作为i级扩培时，应该以ND为培养基，以2%的C02为碳源，以培养48～72h的培养液作为种子。

2.3 pH对微藻生长的影响

pH能够影响溶液中物质的带电性，微生物细胞膜的电荷性以及物质的水解性，尤其是在以C02为碳源的培养系统中，培养基的pH决定了C02，HC032-，C032-等化合物的数量和比例，从而影响物质的吸收与利用以及微藻的生长。一般情况下，培养普通小球藻时，控制培养基的pH为6.5—7.5。本实验设置的初始pH分别为6.00±0.01, 6.50 +0.02, 7.00 +0.02. 7.50 +0.01。以15%的C02为碳源，采用直径为7.5 cm，高度为33 cm的柱式反应器进行培养，装液量为1.2 L，流量为0.02 m3/( m3.min)，采用ND培养基，光照强度为70～80 p*mol/m2.s，实验结果如图3所示。在本实验的培养体系中，高浓度C0-(15%)的曝气培养致使pH值在培养初期下降很快，初始pH值为6.00，6.50，7.00，7.50的培养基的pH值在24 h内分别下降了0.85，1.15，1.28和1.60个单位，随后初始pH值分别为7.00和7.50的培养基的pH值分别保持在5.79和5.93左右，而初始pH值为6.00的培养基的pH值从5.15+0.02上升到5.87+0.09，初始pH值为6.50的培养基的pH值从5.35 +0.05上升到5.77 +0.07。从小球藻生长的OD750变化看，pH低对微藻的生长有一定的抑制作用，初始pH值为6.00的培养基中的微藻的生物量明显低于初始pH值为7.50的培养基。因此，虽然小球藻在前32 h呈现较快的生长速率，但是连续在pH值低于6.00的培养基中生长，其生长仍然会受到抑制。同时说明高浓度C02作为碳源时由于碳酸的形成易导致培养液pH降低，不利于小球藻的生长。

2.4溶解的C02对小球藻胞外碳酸酐酶活性的影响

碳酸酐酶( Carbonic Anhydrase，CA)是微藻光合作用过程中C02浓缩机制(C02 ConcentrationMechanism，CCM)的一个重要的酶，主要负责将溶液中的HC03-转变为C02以满足微藻细胞内合成有机物质的需要。不同微藻含有的碳酸酐酶的种类以及碳酸酐酶处于细胞内的位置有较大差异，并且碳酸酐酶活性的表达与细胞外溶液中含有的C02的浓度相关。研究表明，小球藻(Chlorella.saccharophila)在低C02浓度条件下，CA被诱导表达，而在较高浓度下胞外活性受抑制。Villarej oc发现将小球藻（Chlorella vulgaris）从高浓度C02(5%)培养的条件下转移到空气曝气培养的条件下时，胞内CA活性6 h内增加了6～7倍。可见，CA高活性的表达在某种程度上说明微藻周围微环境中可利用的C02浓度极低，不能满足微藻生长的需求，微藻需要提高碳酸酐酶活性，加快C02的浓缩以满足需要。如果微藻培养过程中，给予微藻充足的C02，满足微藻生长的需求，微藻就不需要启动浓缩机制提高C02在细胞内的浓度，因此，碳酸酐酶活性的丧失或者微量表达表明了所提供的C02能够满足微藻生长的需求，但是，这并不意味着凡是能够使胞外碳酸酐酶活性丧失或微量表达的溶解C02浓度就是满足微藻正常生长的最低浓度。此外，供应的C02在满足微藻生长利用的同时，碳酸酐酶活性的存在可充分利用培养液中的无机碳源中的HC03一，从而提高碳的利用效率。

2.4.1 pH漂移实验

    pH漂移技术是研究微藻利用无机碳机制和能力的方法之一，其原理是在密闭的微藻培养体系内，在持续光照培养过程中，由于培养液中的无机碳被微藻不断地吸收利用可导致培养液的pH值不断升高，当无机碳减少到一定程度的时候，pH则达到一个稳定值，该值为pH补偿点。在淡水培养体系中，pH值大于9时，溶液中游离的C02浓度几乎为零，溶液中主要的离子为HC03一和C 0.32-。在微藻培养过程中，只能利用C02而不能利用HCO，一的微藻不能进一步提高溶液的pH值，所以，如果pH补偿点大于9，说明该微藻具有利用HCO，一离子的能力，即该微藻具有碳酸酐酶活性。如图4所示，本实验中小球藻的pH补偿点为10.97+0.05，说明该微藻具有胞外碳酸酐酶活性。

2.4.2溶解的C02浓度对微藻胞外碳酸酐酶活性的影响

    采用密闭式反应器，通人15%的C02使培养液中的C02浓度分别维持在5.67 xl0 -5,7 xl0一mol/L和l.56xl0-3 mol/L左右，培养36 h后测定胞外碳酸酐酶的活性。实验结果表明．C02溶解浓度分别为5.67 xl0'5.7xl0_4,  1.56xl0-3  mol/L的培养液对应的小球藻胞外碳酸酐酶活性分别为33+5，25+5，68+8 EU/g。据报道，细小微胞藻(M/-cromon,as pusilla)在培养液pH为8.5，溶解的C02浓度为5xl016 mol/L时，胞外碳酸酐酶活性完全受到抑制，椭圆小球藻(Chlorella ellipsoidea)在pH为7.5的培养液中培养时，在C02溶解浓度约为1.4x10-4mol/L时，与CCM相关的酶系包括碳酸酐酶的活性受到全面抑制。而在本实验中，小球藻在溶解C02浓度为5.67xl0-5—l.56xl0-3 mol/L时仍然具有胞外碳酸酐酶活性，这可能与微藻的种类有关。实验结果表明，该藻株生长繁殖过程中在利用水溶性C02的同时可充分利用溶液中的HC03一，从而提高C02的利用效率和微藻产率。

3结论

本文在研究普通小球藻特征吸收峰的基础上，研究了不同培养基、光生物反应器和pH对小球藻生长的影响以及不同的C02溶解浓度对小球藻胞外碳酸酐酶活力的影响。研究结果表明：普通小球藻以750 nm作为测量生物量的波长：该小球藻更适于在ND培养基中生长，在三角瓶、柱式光生物反应器和平板式光生物反应器中，扩大培养的最佳种龄分别为120—144，48～72，48～72 h；长期处于pH低于6的环境下不利于小球藻的生长繁殖；溶解C02浓度为5.67xl0-5—l.56xl0-3 mol/L时不会抑制小球藻胞外碳酸酐酶的活性，小球藻可充分利用水溶性的C02和H2C03-。

4摘要：文章以普通小球藻特征吸收峰研究为基础，研究J-培养基组成、光生物反应器类型、pH对小球藻生长的影响并探讨了不同C02溶解浓度对小球藻胞外碳酸酐酶活性的影响。结果表明，以750 nm作为普通小球藻生物量的测量波长，以ND培养基为培养液，在柱式和平板式光生物反应器中的种子最佳种龄为48～72 h，pH低于6时不利于小球藻生长，C02浓度为5.67x10-5—1.56x10-3 mol/L时，胞外碳酸酐酶的活性没有受到抑制。