一种雌激素受体a磷酸化位点突变体T224A和S559A的构建及其转录激活活性检测新方法

作者：郑晓敏

    目前关于ERa的研究相对较多。ERa含595个氨基酸残基，相对分子质量约为66x103，包含5个结构域，依次为不依赖配体激活的AFI、负责与靶基因启动子的雌激素反应元件(estrogen receptor elements，ERE)特异结合的DNA结合域(DNA binding do-main，DBD)、核定位信号的铰链区、配体结合功能区（ligand-binding domain，LBD）和配体依赖转录的AF2，以及功能不详的可变区。ERa常发生翻译后修饰，如磷酸化、泛素化、甲基化、乙酰化、SUMO、棕榈化，其中以磷酸化最为常见。现已报道的ERa磷酸化位点有十几个，其中研究比较透彻的有7个，为S104、S106、S118、S167、S236、S305及Y537。不同区域磷酸化对ERa的作用也不同，如DBD区的S236位点在蛋白激酶A作用下发生磷酸化，从而抑制ERa_聚化形成，阻断其与DNA的结合；而由Src酪氨酸激酶介导的Y537磷酸化主要调节ERa与E2的结合能力。这些翻译后修饰常常调节ERa与ERE的结合，从而激活或抑制下游基因的转录，包括c- myc、BCL-2、Bcl-XL、Cvc:lin Dl、IL-8，这些下游基因与乳腺癌的发生、发展有着密切的关系。因此，ERa翻译后修饰常为乳腺癌研究的重点和热点。

    本课题组前期在乳腺癌相关研究中，通过质谱分析发现在ERa DBD区224位苏氨酸(T224)和可变区559位丝氨酸(S559)发生磷酸化。虽然559位丝氨酸发生磷酸化已有报道，但对其研究尚少，而224位苏氨酸磷酸化尚无报道。为此，我们构建了ERa 224位苏氨酸、559位丝氨酸磷酸化突变点载体，通过萤光素酶报告基因方法检测这些突变位点对ERa活性是否产生影响。

1  材料与方法

I.I材料

    HEK293T细胞、感受态大肠杆菌DH5a、pRL质粒、ERF启动子的萤光素酶报告基因质粒(ERE-luc)及pcDNA3-Flag均为本实验室保存；真核表达质粒pcDNA3-Flag-ERa为本实验室构建保存；引物合成及测序由奥科鼎盛生物技术公司完成；限制性内切酶、T4DNA连接酶等购自TaKaRa公司；高保真Pfu DNA聚合酶、胶回收试剂盒、质粒提取试剂盒购白Tiangen公司；萤光素酶活性测定试剂盒购自Pro-mega公司；DMEM培养基购自Gibco生物公司；胎牛血清购自杭州江滨公司；转染试剂LipofectAMINE2000购白Invitrogen公司；鼠抗Flag抗体购自SantaCruz公司；雌激素、HRP标记的鼠抗微管蛋白抗体购自Sigma公司；HRP标记的羊抗鼠购自北京中杉金桥生物有限公司。

1.2扩增突变片段

    利用重组PCR扩增ERa( T224A)、ERa(S559A)突变片段，即ACC突变为GCC、TCC突变为GCC。根据ERa基因序列及点突变需要设计引物（表1），由奥科鼎盛生物技术有限公司合成。

    以本实验室构建保存的野生型ERcc质粒为模板，用相应的引物，通过PCR扩增出含有点突变的上、下游目的基因片段（扩增条件：95℃预变性5 min；95℃变性30 s，55℃退火30 s，68C延伸90 s，进行30个循环；68。C延伸7 min），经琼脂糖凝胶电泳及上、下游片段回收，以等摩尔比例的上、下游配对片段为共同模板，利用搭桥法进行二次PCR（扩增条件：950C预变性5 min; 95℃变性30 s，55℃退火30 s，68C延伸120 s，进行30个循环；68C延伸7 min)，扩增出点突变的全长目的基因片段。

1.3构建磷酸化位点突变载体

    把全长点突变片段、pcDNA3-Flag质粒分别用限制性内切酶BamH I /EcoR I于37。C双酶切过夜，利用琼脂糖凝胶电泳回收酶切片段和质粒，再以6：1（片段：质粒）的比例混合，室温连接10 min后把连接产物直接转化大肠杆菌DH5a．在氨苄西林培养板上于37℃培养过夜，筛选阳性克隆，以阳性克隆为模板再次行PCR，确定重组质粒上含有目的基因片段后，送奥科鼎盛生物科技有限公司测序。

1.4细胞培养及转染

    用含10%胎牛血清、200 U/mL青霉素、200 U/mL链霉素的DMEM培养基，在5% CO2、37。C的培养箱中培养HEK293T细胞，当细胞长至10 mm培养皿的60%-80%时用于转染，转染前th更换4 mL新鲜培养基。先把4 μg构建的质粒、4μL转染试剂LipofectAMINE 2000分别加入200 μL生理盐水中混合，静置5 min，把混有转染试剂的生理盐水加入混有质粒的生理盐水中，静置15 min，均匀地加入培养基中，4h后补4-6 mL新鲜培养基。

1.5免疫印迹分析

    转染24 h后收集细胞，加入SDS上样缓冲液（50  mmol/L  Tris- HCI  pH6.8，0.1%溴酚蓝，2%SDS，1 0%甘油，2.5%β一巯基乙醇），沸水浴10 min，离心1 0 min后取上清进行SDS-PAGE，电泳结束后转移至PVDF膜上，用5%脱脂牛奶室温封闭1 h或4℃过夜，然后加入稀释的Flag抗体，室温孵育l h或4℃孵育过夜；用lxTBST冼膜3次，每次5 min，再加入稀释的带有辣根过氧化物酶偶联的羊抗鼠IgG，室温孵育l h，再次用lxTBST洗膜3次，每次5 min，然后将含有辣根过氧化物酶底物的ECL滴加至膜上，随即在暗室中压片显影。

1.6萤光素酶报告基因检测

    把HEK293T细胞接种到6孔板培养，用无指示剂的白色DMEM培养基培养24 h，等长至60%-80%时进行转染。实验组设立分别为：①pcDNA3-Flag（1μg/孔）；②pcDNA3-Flag-ERa质粒（1μg/孔）；③pcDNA3-Flag-ER仪( T224A)突变质粒（1μg/孔）；④pcDNA3-Flag- ERa (S559A)突变质粒（1μg/孔）。以f组均与ERE-luc质粒（0.8 μg/孔）、pRL质粒（0.008μg/孔）共转，培养基中加入或不加入雌激素(10 nmol/l．)，共8组，每组设3个复孔。培养24 h后进行萤光素酶报告基因检测。先用lxPBS洗涤细胞2次，再向各孔中加入100 μL细胞裂解缓冲液，室温轻摇15 min，把细胞裂解物收集到1.5 mL离心管中，4℃、12 000 r/min离心5 min，取30 μL上清用于萤光素酶活性测定。

1.7统计学分析

    实验数据用SPSS13.0统计学软件处理，采用t检验进行统计学分析。显著性概率水平定为P<0.05。

2结果

2.1  ERa T224A．S559A突变基因片段的扩增

    以pcDNA3-Flag-ERa质粒为模板，通过重组PCR扩增点突变的上、下游片段。经电泳鉴定(图1)，T224A上、下游片段为600-1000 bp，S559A上游约1700 bp，下游约100 bp;再以配对上、下游片段为共同模板，二次PCR扩增出全长的突变基因片段，均约1800 bp。

2.2  ERa T224A、S559A突变质粒构建

    将T224A、S559A突变体扩增产物和pcDNA3-Flag质粒均用Ba.mH I lEcoR I双酶切，回收，连接后转入大肠杆菌DH5a，用氨苄西林培养板培养。以阳性克隆菌液为模板，重复PCR检测质粒中是否含有目的基因片段。电泳结果如图2，PCR产物约1800 bp，证明质粒上含有目的基因片段。测序结果进一步证明插入片段为ERa突变体片段（序列略）。

2.3  Western印迹检测ERa突变体的表达

    分别将pCDNA3-Flag-ERa、pcDNA3-Flag-ERa(T224A)、pcDNA3-Flag-ERa( S559A)及对空载体对照pcDNA3-F'Iag质粒转染HEK293T细胞，培养24 h后收集细胞，用抗Flag抗体检测pcDNA3-Flag-FRa(T224A)．pcDNA3-Flag-ERa( S559A)的表达，West-ern印迹结果如图3。与空载体对照组相比，转染pcDNA3-Flag-ERa、pcDNA3-Flag-ERa( T224A)和pcDNA3-Flag-ERa (S559A)的细胞，均显示有一条相对分子质量约66x103的特异性条带，与预期大小吻合，说明pcDNA3-Flag-ERa、pcDNA3-Flag-ERa(T224A)、pcDNA3- Flag- ERa( S559A)在：HEK293T细胞中均获得良好表达。

2.4  萤光素酶报告基因检测突变体活性

    将pcDNA3-Flag、pcDNA3-Flag-ERa、pcDNA3-Flag-ERa( T224A)、pcDNA3-Flag-ERa( S559A)分别与ERE-Iuc和pRL共转入HEK293T细胞，用无指示剂的DMEM培养基培养24 h后收集细胞，行萤光素酶活性检测，结果如图4。无雌激素时，pcDNA3-Flag-ERa、pcDNA3-Flag-ERa (T224A)和pcDNA3-Flag-ERa( S559A)的活性分别是pcDNA3- Flag的1.94，1.49和1.84倍(P<0.05)；与pcDNA3-Flag-ERa(T224A)相比，pcDNA3-Flag-ERa和pcDNA3-F'Iag-ERa (S559A)的活性明显减低(P<0.05)，pcDNA3-Flag- ERa( S559A)与pcDNA3- Flag- ERa的活性差异不显著(P<0.05)。有雌激素时，pcDNA3-Flag活性增加了0.54倍，pcDNA3- Flag- ERa活性增强了1.57倍pcDNA3-Flag-ERa (T224A)和pcDNA3-Flag-ERa( S559A)活性分别增强了0.54和0.61倍，说明在雌激素作用下，pcDNA3-Flag-ERa活性增强明显高于pcDNA3- Flag- FRa( T224A)和pcDNA3-Flag-ERa( S559A) (P<0.05)。因此，在HEK293T细胞中，224位苏氨酸的磷酸化修饰对ERa活性起着重要的作用，同时2个磷酸化位点对雌激素调节ERa的活性也发挥重要作用。

3讨论

    ERa与乳腺癌的发生、发展、转移和治疗效果密切相关，因此乳腺癌的内分泌治疗主要以ERa介导的通路为靶点，如氟维司群(fulvestrant)抑制ERa的表达；他莫昔芬( tamoxifen)竞争性结合ERa，减少雌激素与ERa结合。但在临床上内分泌治疗常常出现耐药性，这些耐药性常与翻译后修饰有关，其中以磷酸化最为常见，因此，研究ERa的磷酸化对探讨耐药机制及药物开发都有重要意义。

    有关ERa磷酸化的研究很多，已报道有十几个磷酸化位点分布在各个区域，其中研究较透彻的位点有7个，包括AF1区的S104、S106、S118、S167．DBD区的S236，LBD区的S305及AF2区的Y537。前期我们通过质谱分析发现，ERa在DBD区的224位苏氨酸和可变区的559位丝氨酸发生磷酸化，而目前关于559位丝氨磷酸化的研究甚少，而224位苏氨酸磷酸化的研究尚无报道。我们通过构建ERa224位苏氨酸、559位丝氨磷酸化位点突变体，利用萤光素酶报告基因活性检测法检测其活性的改变，发现224位苏氨酸突变体活性减弱，而559位丝氨突变体对雌激素调控减弱。这可能与224位苏氨酸处于DBD区有关，该区主要负责与靶基因启动子的ERE结合，发生突变后可能与ERE的结合能力减

弱，从而使ERa活性减弱。可变区功能研究尚未清楚，因结构上与AF2区相邻，可能与AF2区有相似的依赖配体调节ERa活性功能。因此，可变区的559位丝氨突变后，ERa也发生受雌激素调控减弱，但需要进一步研究验证。总之，ERa磷酸化位点突变体的构建及其活性的检测，对ERa的研究有重要意义，对乳腺癌的研究也可提供一定的帮助。

4[摘要]  目的：构建雌激素受体a(ERa)T224A和S559A磷酸化位点突变体载体，在HEK293T细胞中检测其表达及突变体生物活性的改变。方法：以pcDNA3-Flag-ERa为模板，通过重组PCR技术扩增目的基因片段并突变碱基，插入pcDNA3-Flag载体；将构建的质粒转染HEK293T细胞进行瞬时表达，通过Western印迹检测融合蛋白的表达，采用萤光素酶报告基因方法检测ERct突变体的活性改变。结果：T224A和S559A磷酸化位点突变体在HEK293T细胞中得到表达，相对分子质量为66x103。在无雌激素(E：)时，野生型ERa及T224A和S559A突变体的转录活性分别为空载体的1.94、1.49和1.84倍；在雌激素存在时，野生型ERcc活性增强了1.57倍，T224A和S559A突变体活性分别增强了0.54和0.61倍。结论：224位Thr磷酸化修饰对ERa的活性起重要作用，且2个磷酸化位点突变体受雌激素调控减弱