作者：郑晓敏
农作物秸秆在我国较为廉价且资源丰富，年产近7亿t，但这些资源却未被充分利用，且常因就地焚烧而污染环境。另一方面我国石油资源有限，是世界第二大石油进口国，仅2013年就进口3.78亿t。因此，发展生物燃料乙醇技术对我国更有意义。目前制约纤维素乙醇商业化的主要瓶颈是乙醇转化率不高，生产成本较高，与粮食乙醇相比没有优势。本研究利用真菌对玉米秸秆进行降解，用酿酒酵母对真菌降解液进行乙醇发酵，并优化了影响乙醇产率的主要因素，为以玉米秸秆为原料制取燃料乙醇提供一定的依据。
1材料与方法
1.1材料
1.1.1玉米秸秆
玉米秸秆取白包头市郊区农田，粉碎成3 mm以下的颗粒，洗净烘干，用质量分数为0.75%的稀硫酸在121℃下处理th，水洗至中性，干燥后备用。
1.1.2发酵菌种
绿色木霉、黑曲霉、新月弯孢霉和酿酒酵母均由本实验室储藏。
1.1.3培养基
基础液体发酵培养基：40 g经过预处理的秸秆，KH2P04 0.5 g,MgS04 -7H20 0.1 g,NaCl 6.0 g,K2HP04 2.0 g，(NH)4S04 2.0 g．VB1微量，pH自然，加水定容至1 000 mL。分装于250 mL三角瓶，121℃下灭菌30 min。
液体PDA培养基：葡萄糖20 g，KH2P043 g，MgS04-7H20 1.5 g，马铃薯200 g煮汁，VB1微量，定容至1 000 mL，pH自然；121 0C下灭菌30 min。
酵母培养基：酵母膏10 g，蛋白粉20 g，葡萄糖20 g，定容至1 000 mL。分装于150 mL三角瓶，121℃下灭菌30 min。
1.2方法
1.2.1种子液制备
将绿色木霉、黑曲霉、新月弯孢霉和酿酒酵母分别接种到液体PDA培养基和酵母培养基中进行扩增培养，菌悬液作为种子。
1.2.2秸秆降解
将绿色木霉、黑曲霉、新月弯孢霉种子液按不同方式接种到基础液体发酵培养基中，在温度为28℃，摇床转速为150 r/min条件下进行秸秆降解。分别在第3，5，7，9天测定培养液中纤维素酶酶活。
①单一菌株培养降解秸秆
将绿色木霉、黑曲霉、新月弯孢霉种子液分别按10%接种量接种至基础液体发酵培养基中。
②混菌培养降解秸秆
将绿色木霉和黑曲霉种子液分别按5%接种量接种至基础液体发酵培养基中。
将绿色木霉和新月弯孢霉种子液分别按5%接种量接种至基础液体发酵培养基中。
将黑曲霉和新月弯孢霉种子液分别按5%接种量接种至基础液体发酵培养基中。
将绿色木霉、黑曲霉和新月弯孢霉种子液分别按3.5%接种量接种至基础液体发酵培养基中。
1.2.3乙醇发酵
将冰箱中保藏的酿酒酵母进行活化，活化后接人到酵母培养基培养种子，取种子培养液按一定比例的接种量接人到发酵培养基进行乙醇发酵，间隔一定时间检测乙醇浓度。
1.2.4分析方法
发酵液经过滤离心后，取2 mL上清液，经0.45um微孔滤膜过滤，采用气相色谱法测定乙醇含量。采用3，5二硝基水杨酸(DNS)法测定还原糖含量。
2结果与分析
2.1降解秸秆真菌的选择
采用单一真菌及多种真菌组合的秸秆降解物中纤维素酶酶活测量结果如图1所示，其中，只有新月弯孢霉纯培养降解秸秆时酶活高峰出现在第3天，但酶活力最低；其它6种降解方式酶活高峰均出现在第5天，绿色木霉和黑曲霉混菌培养的降解液酶活最高，因此，优化试验选取绿色木霉和黑曲霉混合培养降解液。新月弯孢霉纯培养产酶低可能是由于其比较容易利用青玉米叶片营养成分，对以枯黄玉米秆为主的秸秆成分利用率较低。而绿色木霉和黑曲霉产纤维素酶较高，降解产生还原糖后可能会抑制产物的形成，降低了纤维素酶的分泌，另外，由于震荡剪切等因素导致酶蛋白变性失活，因此酶活高峰出现在第5天。
2.2降解时间对乙醇含量的影响
酵母发酵依赖于纤维素降解菌降解秸秆后产生的还原糖。因此，将绿色木霉和黑曲霉分别以5%的接种量接种到基础液体发酵培养基，在第48，72，96，120，144 h分别加入酵母，发酵24 h后测定乙醇含量，结果如图2所示。从图2可以看出，在降解120 h后加入酵母，乙醇产量最高，达到了10.14 mg/mL，乙醇产率（乙醇质量与总糖质量之比）为0.29 g/g，为最大理论值的56.86%。
2.3加入酵母后发酵时间对乙醇含量的影响
图3为降解液在加入酵母（接种量为10%）12，24，36，48，60，72 h后分别测定的乙醇含量。从图3可以看出，发酵前24 h乙醇产量增长较快，在发酵第24 h乙醇含量达到最高值10.60mg/mL，乙醇产率为0.30 g/g，为最大理论值的58.82%，此后乙醇含量增加很小。因此选取投加酵母后发酵24 h为最适发酵时间。
2.4酵母的接种量对乙醇含量的影响
将酵母种子液分别以5%，10%，15%，20%，25%的接种量加入到降解液中，在发酵第24 h测定乙醇含量，结果如图4所示。从图4可以看出，酵母的接种量为15 %时乙醇含量达到最高值，为10.91 mg/mL，乙醇产率为0.31 g/g，为最大理论值的60.78%。
2.5培养温度对乙醇含量的影响
以15%的接种量将酵母接种到降解液中，分别在25，28，31，34，37℃发酵24 h，测定乙醇含量，结果如图5所示。从图5可以看出，在28℃时乙醇含量最高，达到11.43 mg/mL，乙醇产率为0.33 g/g，为最大理论值的64.71%。
2.6发酵液初始pH对乙醇含量的影响
以15%的接种量将酵母接种到初始pH分别为3.5，4.0，4.5，5.0，5.5 ,6.0，6.5的降解液中，在28℃发酵24 h．测定乙醇含量，结果如图6所示。从图6可以看出，在初始pH为3.5—5.5的发酵液中，酿酒酵母发酵乙醇产量处在较高水平，乙醇含量最高可达到11.85 mg/mL，乙醇产率为0.34 g/g，为最大理论值的66.67%。初始pH高于5.5时，乙醇含量下降较多。
3结论
利用绿色木霉和黑曲霉联合对玉米秸秆进行降解的效果要好于采用单一菌种和其它菌种组合。在降解时间为120 h后加入酵母，乙醇产量最高，达到了10.14 mg/mL，乙醇产率为0.29 g/g，为最大理论值的56.86%。
对玉米秸秆降解液生产乙醇的发酵条件进行优化，确定了最佳发酵条件：降解液加入酵母后的发酵时间为24 h，酵母的接种量为15%．发酵温度为28℃，发酵液初始pH为3.5—5.5时，乙醇产量最高值可达11.85 mg/mL，乙醇得率由56.86%提高至66.67%。
4摘要：该研究利用一种真菌纯培养和多种真菌混合培养降解玉米秸秆产生可发酵糖，并对秸秆生物降解液进行发酵生产乙醇，同时研究了玉米秸秆生物降解液发酵生产乙醇的最佳条件。结果表明：采用绿色木霉和黑曲霉混合培养降解秸秆时的纤维素酶活力高于其它6种降解方式；利用绿色木霉和黑曲霉组成的混合菌对秸秆进行降解后得到的降解液生产乙醇，在秸秆降解时间为120 h，酵母发酵时问为24 h，酵母接种量为15%，温度为28℃，初始pH为3.5—5.5时保持较高的乙醇产率，乙醇含量最高值可达11.85 mg/mJ。，乙醇得率由56.86c7c,提高至66.67%。
