关于小分子化合物Me6TREN促进小鼠骨髓中造血干/祖细胞增殖的研究

作者：郑晓敏

  目前，临床上主要采集外周血中的造血干/祖细胞作为移植细胞来源。在正常情况下，外周血中的造血干/祖细胞数量有限，为获得足够数量的造血干细胞，需要使用动员剂如粒细胞集落刺激因子(C-CSF)将骨髓中的造血干/祖细胞动员至外周血循环中。我们新发现的小分子化合物Me6TREN（以下简称Me6）也具有将骨髓造血干/祖细胞动员至外周血的能力，有望成为一类新型的造血干/祖细胞动员剂候选药物。近年来，脐带血造血干细胞移植在临床上的应用逐年增多。但脐带血中的造血干/祖细胞数量较少，一份脐带血不能满足成年病人的治疗细胞量，因此需要对其进行扩增来获得足够数量的造血干/祖细胞，目前已有研究团队开展体外扩增的造血干/祖细胞移植病人的临床试验。优化造血干细胞扩增的培养体系，有助于进一步推动脐带血来源的造血干/祖细胞的临床应用。

    Me6是一类饱和胺类化合物，属于一类新型医药中间体，可用于制备远螯聚合物的原子转移自由基聚合( ATRP)配体。我们在前期工作中发现，单次皮下注射Me6能将小鼠骨髓中的造血干/祖细胞快速有效地动员至外周血中。传统的造血干/祖细胞动员剂C-CSF在动员造血干/祖细胞的同时，能促进造血干/祖细胞的扩增，而化合物Me6是否也能够促进造血干/祖细胞的扩增尚不明了。为此，我们检测了皮下注射Me6的小鼠骨髓内造血干/祖细胞数量及比例的变化，并利用体外培养体系进一步考察了该化合物是否影响造血干/祖细胞的增殖。

1  材料和方法

1.1材料

    雄性C57BL/6小鼠，体重18-20 9，购自北京维通利华实验动物技术有限公司，生产许可证：SCXK-（京）2012-0001；饲养于军事医学科学院SPF级实验动物房。将雄性C57BL/1小鼠随机分为对照组(Con组)和Me6组。检测前12 h，对Me6组C57BL/6小鼠皮下注射Me6，剂量为5 mg/kg;对照组注射PBS。

    Me6TREN购自Sigma公司；红细胞裂解液购自BD公司；小鼠淋巴细胞分离液购白灏洋生物制品科技有限责任公司；流式抗体Lineage APC-Cv7(CD3，CDllb, Ter- 119, B220, Lv-6G)、Sca-1 PE-Cv7、c-Kit Alexa Fluor 700均购自eBioscience公司；仪一MEM培养基、胎牛血清购自Gibco公司；干细胞生长因子(SCF)、重组人血小板生成素(TPO)、白细胞介素3（IL-3）、白细胞介素6（IL-6）均购自Peprotech公司；半同体集落培养基M3434购自StemCell公司。

1.2小鼠骨髓单个核细胞的分离培养

    用颈椎脱臼法处死小鼠后，置于75%酒精中消毒，在无菌环境下分离小鼠股骨，用1 mL注射器吸取培养液，将骨髓细胞冲出至离心管中，2000 r/min离心5 min，得到细胞沉淀，用5 mL PBS重悬细胞，加到等体积的淋巴细胞分离液上层，2000 r/min离心20 rriin（离心机调至慢升慢降），收集中间层细胞，用PBS洗涤2次，得到单个核细胞。将细胞种于含有500 μL培养基（a-MEM培养基中加入10%胎牛血清，SCF 50 ng/mL，TP0 10 ng/mL，IL-3 10 ng/mL，IL-6 10 ng/mL）的24孔低吸附板，放入370C、5% CO2培养箱中培养。

1.3  小鼠骨髓造血干/祖细胞集落形成能力的检测

    将小鼠半同体集落培养基(M3434)加入24孔低吸附板中，避免产生气泡，然后将细胞以5XIO3/孔的密度接种到24孔板，放入37C、5% CO2培养箱中培养；7 d后，在显微镜下对形成的造血集落形成单位(colonv-forming unit，CFU)进行计数；14 d后，对高增殖潜能集落形成单位(high-proliferative-potential CFU，HPP-CFU)进行计数。

1.4  小鼠骨髓造血干/祖细胞表面标志的检测

    将分离得到的小鼠骨髓细胞用红细胞裂解液处理后，取2x106细胞，用100μL PBS重悬至1.5 mLEP管中，加入抗体(Lineage、Sca-I、c-Kit)，充分混匀后置于旋转混合器上，4℃避光孵育30 min，然后用PBS洗涤细胞2次，800 r/min离心5 min，用300μL PBS重悬细胞，转移至流式管中，用BD流式细胞仪检测。

2结果

2.1  小分子化合物Me6对小鼠骨髓细胞集落形成能力的影响

    C57BL/6小鼠皮下注射Me6，剂量为5 mg/kg，12 h后分离小鼠骨髓单个核细胞，进行集落形成能力的检测。7d后，对2组骨髓细胞的造血CFU进行计数比较，由结果（图1A）看出，与Con组小鼠( 87.67+4.096)相比，Me6组小鼠(108.0+2.646)骨髓单个核细胞所形成的集落数显著增加(P=0.014)：14 d后，对HPP-CFU进行计数比较，由结果（图lB）看出，Me6组(18.75+1.109)小鼠HPP-CFU的数量较Con组(14.33+0.667)也明显增加(P=0.0269)。这组结果表明Me6能增加小鼠骨髓中造血祖细胞的数量。

2.2  小分子化合物Me6对小鼠骨髓中造血干、祖细胞的比例及数量的影响

    将分离得到的Con组和Me6组小鼠骨髓单个核细胞进行流式细胞术分析，考察造血干/祖细胞的表面标志lin-Sca- l+c-Kit+( LSK)的表达情况。检测结果（图2）显示，与Con组(0.1412+0.01535)小鼠相比，Me6组(0.2451+0.04030)小鼠骨髓中造血干/祖细胞的比例显著增加(P=0.0337)。

2.3  小分子化合物Me6对体外培养的小鼠骨髓单个核细胞的影响

    体外分离小鼠骨髓单个核细胞，在培养体系中添加小分子化合物Me6，培养4d后，对Con组和Me6组细胞总数进行比较。结果（图3）显示，2组细胞的细胞总数没有显著差别( P=0.3769)。

2.4  小分子化合物Me6对体外培养的小鼠骨髓单个核细胞的集落形成能力的影响

    将在体外分离培养的小鼠骨髓单个核细胞分为Con组和Me6培养组，取培养4d的细胞进行集落形成能力的检测。7 d后，对Con和Me6两组细胞的造血CFU进行计数比较，由结果（图4A）看出，与Con组( 81.75+3.568)相比，Me6组(120.8+5.023)所形成的集落数增加( P=0.0007)；14 d后，对HPP-CF-'U进行计数比较，由结果（图4B）看出，Me6组(19.67±1.202)HPP-CFU的数量较Con组(14.25+1.436)也明显增加( P=0.0406)。这组结果表明化合物Me6能增加体外培养的骨髓单个核细胞中造血祖细胞的数量。

2.5  小分子化合物Me6对体外培养的小鼠骨髓单个核细胞中造血干/祖细胞增殖能力的影响

    将在体外分离培养的小鼠骨髓单个核细胞分为Con组和Me6组，进行流式细胞术分析造血干/祖细胞（lin-Sca- l+C-Kit+）的增殖情况。检测结果（图5）显示，与Con组(0.009625+0.001216)相比，Me6组( 0.01515+0.0007304)造血干/祖细胞中Ki-67的比例增加( P=0.0176)。这说明化合物Me6能促进体外培养的骨髓单个核细胞中造血干/祖细胞的增殖。

3讨论

    造血干/祖细胞是研究最为深入的成体干细胞，它具有自我更新以及分化成各系成熟血细胞的能力。在成体内，造血干/祖细胞主要定居于骨髓中。骨髓中的造血干/祖细胞不断地增殖分化形成各种血细胞，并和各种血细胞不断地在骨髓和外周血之间循环。如今，造血干/祖细胞移植可以用来治疗多种血液疾病，但南于获得的造血干/祖细胞数量有限（如脐带血中的造血干/祖细胞数量较少），直接影响了移植的效率，因此需要对造血干/祖细胞进行扩增。当前用于造血干/祖细胞扩增的方法很多，包括细胞因子、高通量筛选得到的小分子化合物、基质细胞等。体外扩增使细胞脱离了体内的微环境，可能会增加细胞的凋亡；此外，扩增可以使细胞数量增多，但有可能增加的是成熟细胞而不是干细胞，扩增后造血干/祖细胞的长期植入能力可能并未得到提高。因此，对造血干/祖细胞的扩增，需要的不仅仅是表型，还有功能性的提高，使其移植后能快速有效地重建患者的造血和免疫系统。

我们的前期研究表明Me6具有很好的动员作用，能将骨髓中造血干/祖细胞动员至外周血中，增加外周血中造血干/祖细胞的比例及数量。在本研究中，我们发现Me6还能促进小鼠骨髓造血干/祖细胞的增殖。对实验小鼠皮下注射Me6，12 h后检测小鼠的骨髓，可发现骨髓细胞的集落形成能力增强，并且造血干/祖细胞的比例及数量也有所增加。这些结果提示该化合物在动员造血干/祖细胞的同时，可能促进了骨髓造血干/祖细胞的扩增。我们的芯片检测结果也提示化合物可能调节了Notch信号通路，文献报道该通路具有促进造血干/祖细胞扩增的能力。为进一步确定化合物Me6是否具有体外促进造血干/祖细胞扩增的能力，我们在体外分离培养了小鼠骨髓单个核细胞，向培养体系中加入化合物Me6，培养4d后Me6组细胞的集落形成能力及增殖的造血干/祖细胞的比例都增加了，这些结果提示Me6具有体外促进造血干/祖细胞扩增的能力。对于小分子化合物Me6是否能促进造血干/祖细胞的长期扩增及其可能的机制仍须进行深入的研究。

4[摘要]  目的：探讨小分子化合物Me6TREN对小鼠骨髓中造血干/祖细胞的增殖作用。方法：采用细胞计数、细胞集落形成能力检测、流式细胞术检测细胞表面标志等实验技术，观察Me6TREN对小鼠骨髓细胞的影响。结果：皮下注射Me6TREN 12 h后，Me6TREN组的集落形成能力、造血干/祖细胞表面标志lin—Sca- l+c-Kit+的比例均明显高于对照组：在体外分离培养的小鼠骨髓单个核细胞，4d后Me6TREN组细胞的集落形成能力及造血干/祖细胞的增殖能力均高于对照组。结论：Me6TREN对小鼠骨髓造血干/祖细胞有一定的促增殖作用。