关于人自噬相关基因12真核表达载体的构建及表达的研究

作者：郑晓敏

   研究发现自噬参与肿瘤、病原体免疫的过程，自噬可通过一系列机制将肿瘤细胞、入侵的病原体1等降解，其机制为，来自高尔基复合体或粗面内质网的单层或双层膜将抗原包裹后形成自噬泡，自噬泡的外膜与溶酶体膜融合，内膜及其包裹的物质进入溶酶体腔，被溶酶体中的酶水解，从而维持机体稳定。

    ATG12可以和ATG5、ATG16结合形成复合物，该复合物参与自噬体的形成，在白噬过程中发挥重要作用。ATG3蛋白是一种泛素样缀合酶，它和ATCIO是促进ATG8和ATC12泛素样蛋白结合的2种F2样酶。有文献报道称，在白噬过程中ATG12可与ATG3相互作用。鉴于ATG12在白噬中的重要作用，我们拟构建ATG12的真核表达载体，并验证表达的myc-ATG12融合蛋白与ATG3的相互作用，为进一步研究ATG12与自噬的关系奠定基础。

1  材料和方法

1.1材料

    人胚肾293T细胞由本室传代培养；pXJ-40-myc载体为本实验室保存；Flag-ATG3质粒为本实验室前期构建；VigoFect为威格拉斯生物技术有限公司产品；限制性内切酶、DNA连接酶、PCR试剂均购自TaKaRa公司；上、下游引物由北京赛百盛生物技术有限公司合成；质粒提取、胶回收、PCR回收试剂盒购自Promega公司；HRP标记的抗myc标签鼠单克隆抗体( myc-HRP)和抗Flag标签鼠单克隆抗体(Flag-HRP)购白Sigma公司；DMEM及小牛血清购自Gibco公司；测序由北京奥科生物技术有限责任公司完成。

1.2  mvc-ATG12重组质粒的构建与测序

    以本实验室保存的人乳腺文库为模板，根据文献报道…”的ATG12编码序列合成上游引物（5'-CGCGATCCATGGCGGACGAGCCCCAGTCTG-3'）和下游引物（5'一CCGCTCGACTCATCCCCACGCCTGAGACTTGC-3')，PCR扩增人ATG12的编码序列（扩增条件：95℃预变性5 min；95C变性30 s，600C退火30 s，720C延伸30 s，30个循环；720C延长7 min），用胶回收试剂盒回收PCR产物。

    用BamH I /Xho I双酶切pXJ-40-myc载体，经10 g/L琼脂糖凝胶电泳后，胶回收载体大片段；将PCR片段回收后再用BamH I lXho I酶切，形成带有粘端的双链，用T4DNA连接酶连接入pXJ-40-myc载体；转化大肠杆菌DH5a，挑选克隆，振荡培养并提质粒，用BamH I lXho I双酶切鉴定，酶切鉴定正确的克隆送北京奥科生物公司测序。

1.3哺乳动物细胞转染和Western印迹检测

    按常规方法进行转染，用不含双抗、含100 mL/L胎牛血清的DMEM培养基将293T细胞接种于6cm皿中，接种量以转染时细胞密度达80%为宜，培养24 h后进行转染，转染前1 h换液。将4μLVigoFect与200 μL NaCI混合，再将总量为10 μg的重组质粒与200 μL NaCl混合，然后将上述2种溶液轻轻混合，室温放置15 min，加入6 cm皿中，并以同样方法转染空pXJ-40-myc载体作为对照，37℃、5% CO2常规培养，4-6 h换液。质粒转染293T细胞24 h后收集细胞蛋白，加入2xSDS加样缓冲液，煮沸10 min，高速离心2 min，取上清液进行SDS-PAGE后电转移至硝酸纤维素膜上；用5%脱脂奶粉于4℃封闭过夜，加入用5%脱脂奶粉以1：5000稀释的用HRP标记的抗myc标签鼠单克隆抗体，室温轻摇1 h，TBST洗膜3次，每次5 min；用化学发光法显色5 min，压片显影。

1.4免疫共沉淀检测ATG12和ATC3的相互作用

    将人胚肾293T细胞接种于6 cm皿中，用重组myc-ATG12与Flag-ATC3共转染细胞，转染后4-6h换液，常规培养24 h后收集细胞，加入中盐(0.25mol/L) IP缓冲液后与myc- beads于4℃结合4-6 h，3000 r/min离心5 min，经中盐IP缓冲液再次漂洗后，加入与myc-bcads等量的2xSDS加样缓冲液，煮沸10 min，12 000 r/min离心2 min，取上清液进行SDS-PAGE后电转移至硝酸纤维素膜上，用5%脱脂奶粉于4℃封闭1 h，加入用5%脱脂奶粉以1：5000稀释的用HRP标记的抗myc和Flag标签鼠单克隆抗体，室温轻摇l h，TBST洗膜3次，每次5 min，用化学发光法显色，5 min后压片显影。

2结果

2.1  myc-ATC 12重组质粒的构建与鉴定

    以实验室保存的人乳腺文库为模板，PCR扩增人ATG12的编码序列，获得约420 bp的DNA片段，与预期一致（图1）。将PCR产物用BamH I IXhoI双酶切后，与经同样双酶切的pXJ-40-myc载体连接，转化大肠杆菌DH5α，挑选阳性克隆提质粒，经酶切鉴定，可切出2条长度分别约为5000和420 bp的条带，而相应的空载体酶切只见大片段，符合预期结果（图2）。测序结果表明，插入片段的DNA序列与人ATC12基因的编码序列完全一致（数据略）。

2.2  Western印迹检测mvc-ATG12在293T细胞中的表达

    将构建的mvc-ATG12重组质粒和空载体分别转染293T细胞，24 h后提取蛋白进行SDS-PAGE，Western印迹检测myc-ATG12蛋白的表达。结果显示，转染重组质粒后，用mvc-HRP抗体能够在相对分子质量约17x103处检测到明显的特异性条带，而空载体则无条带（图3）。说明myc-ATG12重组蛋白在293T细胞中能够正确表达。

2.3  免疫共沉淀检测ATG12与ATG3的相互作用

    根据文献报道，ATG12可与ATG3蛋白相互作用。为进一步证实构建的myc-ATG 12重组质粒正确，且能够表达正确的融合蛋白，将重组myc-ATG12质粒与Flag- ATG3质粒共转染293T细胞，24 h常规培养后收集蛋白，免疫共沉淀分析观察显示，mvc-ATG12融合蛋白与Flag-ATG3蛋白具有相互作用，而myc空载体在同一位置无此条带，表明ATG12与ATG3蛋白能够在体内特异地相互作用，而myc标签不影响ATG12的结构及其生物学功能（图4）。进一步证明构建的重组mvc-ATC 12质粒正确，且能够正常表达。

3讨论

    自噬是一种普遍而又重要的生命现象，广泛参与多种生理和病理过程，特别是与肿瘤发生密切相关。目前，自噬的调控作用被广泛关注并加以研究，以求从分子水平上对肿瘤进行治疗，从而达到根治的目的。针对ATG的调控是现在自噬研究的热点。根据其在自噬过程的不同阶段发挥作用的不同，可将ATG分为以下三类：一是ATGI-ATG11-ATG17- ATC20- ATG24- ATG29- ATC31和ATC13-ATC8复合体，二是ATG6-ATG14-Vps34-Vps15复合体，三是ATG12-ATC5-ATG16和LC3-II-PE泛素样蛋白系统。可见ATG12与自噬体的形成密切相关。有研究显示ATG12缺失的小鼠胚胎干细胞前自噬体结构和自噬体的数量明显减少。

ATG12定位于细胞质和自噬体中，同时介导自噬和凋亡两条通路，在自噬过程中和ATG5的结合是不可逆的，同时与ATC3的结合区域也有很多疑惑待解决。本实验构建的myc-ATG 12在真核细胞中获得了表达，且表达的融合蛋白能够与ATG3蛋白相互作用。ATG12在真核细胞中的成功表达，是继续深入研究其在自噬中的作用机制，以及探讨其利用价值的基础。

4[摘要]  目的：构建带mvc标签的自噬相关基因12(ATG12)的真核表达载体，获得n．vc-ATC12融合蛋白。方法：以人乳腺文库为模板，采用PCR技术扩增人ATG12编码序列，将其插入pXJ-40-．nyc载体构建重组质粒，转染人胚肾293T细胞，Western印迹检测表达情况；将重组质粒与ATG3表达质粒共转染293T细胞，免疫共沉淀法检测二者的相互作用。结果：myc-ATC12真核表达质粒构建成功，转染293T细胞后融合蛋白获得表达，其相对分子质量约17xl03.可与Flag- ATC3结合。结论：构建并表达了带mvc标签的人ArlG12真核表达载体，为进一步研究ATG12在自噬中的功能奠定了基础。