关于人乳头瘤病毒1 8型L1蛋白在昆虫杆状病毒系统中表达的研究

  作者：郑晓敏

   目前，上市的HPV16/18型二价HPV疫苗和HPV6/11/16/18型四价HPV疫苗均在9-26岁女性中用于预防宫颈癌，但价格较贵，且只能预防2种高危型HPV型别。因此，研发抗原谱广、价格便宜、使用方便的新型HPV疫苗具有重要意义。由于HPV具有多样性、体外培养困难和潜在的致癌性等特征，HPV疫苗研发难以采用减毒活疫苗或死疫苗技术，只能进行基因工程疫苗研发。L1蛋白是HPV疫苗研究的主要靶抗原。昆虫杆状病毒表达系统具有磷酸化、糖基化和蛋白切割加T修饰等功能，表达产物的生物学特性与天然产物相似，安全性较高，制备过程简单，适用于蛋白质T程研发。我们利用杆状病毒表达系统表达Ll蛋白，为进一步研究新型HPV疫苗奠定基础。

1  材料与方法

1.1材料

    昆虫细胞Sf9和载体pFastBacl购自美国Invitro-gen公司；大肠杆菌DH5a和DHIOBac由本科室保存；L1基因根据NCBI提供的HPV18野生型L1基因序列（NC_001357.1）人工合成，全长1629 bp。

    PCR仪、限制性内切酶和转染试剂CeIIFectin购白美国Invitrogen公司；DNA凝胶回收试剂盒和PCR产物回收试剂盒购白TaKaRa公司；蛋白质和DNAmarker购自北京博迈德科技发展有限公司；鼠抗Ll单克隆抗体购自Fitzgerald公司；昆虫细胞培养基Sf900ⅡSFM和Grace不完全培养基购自Gihco公司；HRP标记羊抗小鼠IgG抗体购自北京中杉金桥生物技术有限公司。

1.2  HPV18 11序列的优化及TA克隆

    为提高杆状病毒系统目的蛋白表达量，本实验根据Sf9细胞密码子使用偏性，参考CenBank中HPV18 11基因组序列，在不改变氨基酸序列的前提下，将Ll基因编码区序列进行优化，并在基因起始密码子区域添加Kozak序列，在5'和3'端分别添加EcoR I和Xba I限制性酶切位点，送Invitrogen公司合成。将L1序列连接至pMD18-T载体，转化宿主菌，挑克隆进行PCR和测序，鉴定正确的重组克隆质粒命名为pMD18T-LI。

1.3  重组杆状病毒转移载体pFBI-LI的构建

    将重组克隆质粒pMD18T-LI和pFastBacl分别用EcoR I和XbaI双酶切，回收L1基因片段和pFastBacl载体片段，经T4DNA连接酶于16。C连接2h，连接产物转化感受态大肠杆菌DH5a，提取质粒，经EcoR I和Xba I双酶切鉴定，送Invitrogen公司测序。鉴定正确的重组杆状病毒转移载体命名为pFBl-LI。

1.4重组杆状病毒穿梭质粒rBacmid-L1的构建

将转移载体pFBl-Ll转化含Bacimd和Helper质粒的大肠杆菌DHlOBac感受态细胞，经50μg/ml．卡那霉素、7μg/mL庆大霉素、10μg/mL四环素和蓝白斑筛选，挑取白色菌落并对其反复稀释筛选，挑取克隆，采用通用引物

M13F(5'-CCCAGTCACCACGTTGTAAAACG- 3-)、

M13R( 5'- AGCCGATAACAATTTCACACAGG-3-)

进行PCR鉴定（反应条件：93℃预变性3 min；95℃变性45 s，55℃退火45 s，72℃延伸5 min，共30个循环；72℃再延伸7 min），将PCR产物送Invitrogen公司测序，鉴定正确的重组杆状病毒穿梭质粒命名为rBacmid-L1。

1.5  重组杆状病毒rBacmid-LI的包装

    按照Bac-to-Bac说明书，使用CellfectinⅡ转染试剂将重组质粒rBacmid-LI转染对数生长期的Sf9细胞，以仅含脂质体的等量转染试剂转染Sf9细胞作为阴性对照，显微镜下观察致细胞病变。转染7d后收集上清，即为第一代重组杆状病毒，命名为rBac-L1-P1。将rBac-LI-PI按MOI=0.1，细胞数为1X106传代，感染对数生长期的Sf9细胞，4d后出现细胞病变时收集上清，即为rBac-L1-P2，按此方法获得rBac-L1-P3。

1.6重组杆状病毒的鉴定

1.6.1  PCR鉴定用DNA提取试剂盒提取感染rBacmid-L1的Sf9细胞的病毒基因组，以其为模板、M13F和M13R为引物，PCR扩增L1基因，反应条件同1.4，1%琼脂糖凝胶电泳鉴定。

1.6.2  间接免疫荧光法鉴定  将重组杆状病毒rBacmid-LI感染96孔板中培养的Sf9细胞，以仅含脂质体的等量转染试剂转染Sf9细胞作为阴性对照，3d后移去培养上清，加入80%丙酮室温同定细胞10 min;弃丙酮，加入HPV18 11抗体，置37℃孵育1 h；加入FITC标记的羊抗小鼠IgG抗体，置37℃孵育1h；加入60%甘油溶液封板，荧光显微镜下观察。

1.6.3  Western印迹鉴定  重组杆状病毒rBacmid-L1感染Sf9昆虫细胞3 c1后，离心收集上清和细胞沉淀。将上清用超滤管进行浓缩，细胞沉淀用PBS重悬，分别取20 pL样品，经12% SDS-PAGE分离，电转移至NC膜上，5%脱脂奶封闭过夜；加入小鼠抗L1单克隆抗体，37℃孵育1 h；加入HRP标记的山羊抗小鼠IgG抗体，37℃孵育0.5 h，加入TMB显色5min。

2  结果

2.1  HPV18 11序列的优化及TA克隆

    按照Sf9细胞密码子嗜性优化L1基因序列，氨基酸序列未发生改变。将重组克隆质粒pMD18T-L1进行PCR，经琼脂糖凝胶电泳分析，可见1629 bp的L1基因片段（图1）。测序结果显示重组质粒pMD18-T-L1的序列正确。

2.2转移栽体pFBl-L1的鉴定

    转移载体pFBI-L1的双酶切产物经琼脂糖凝胶电泳分析，可见5238 bp的载体片段和1629 bp的L1基因片段，大小与预期相符（图2）。测序结果表明，所获得的基因序列与L1基因的序列同源性为100%。

2.3  重组杆状病毒穿梭质粒rBacmid-L1的鉴定

    重组杆状病毒穿梭质粒rBacmid-L1的PCR产物经琼脂糖凝胶电泳分析，可见约3829 bp(1629+2300 bp)的基因片段，与预期相符（图3）。测序结果表明，所获得的基因序列与L1基因序列的同源性为100%，表明L1基因已整合到Bacmid质粒上。

2.4  重组杆状病毒的包装

    穿梭质粒转染Sf9细胞3d后，在显微镜下观察。与阴性对照细胞相比，细胞变圆、变亮，问距变大，细胞出现破碎、脱落；转染7d后细胞大片脱落，有明显细胞病变（图略）。

2.5  重组杆状病毒的鉴定

2.5.1  PCR鉴定  提取感染rBacmid-LI的Sf9细胞的病毒基因组，以其为模板行PCR扩增，产物经l%琼脂糖凝胶分析，可见约3829 bp(1629+2300 bp)的片段，与预期相符（图4）。测序结果显示重组质粒rBacmid-Ll的序列正确，表明重组杆状病毒基因组中整合了L1基因。

2.5.2  间接免疫荧光法鉴定  间接免疫荧光结果显示，感染rBacmid-LI的Sf9细胞可见绿色荧光，而仅含脂质体的转染试剂转染的Sf9细胞（阴性对照）无荧光（图5），表明重组杆状病毒的L1基因在Sf9昆虫细胞中获得表达。

2.5.3  Western印迹鉴定  Western印迹结果显示，rBacmid-L1感染的Sf9细胞的上清中无特异性条带，而细胞沉淀可与鼠抗Ll单克隆抗体发生特异性反应，在相对分子质量约60 000处可见特异性条带，大小与L1蛋白相符，仅含脂质体的转染试剂转染的Sf9细胞无特异性条带产生（图6）。表明L1基因已在rBacmid-L1感染的Sf9细胞中得到表达。

3讨论

    昆虫杆状病毒表达系统(baculovirus expres-sion vector system，BEVS)是继大肠杆菌、酵母和哺乳动物细胞表达系统后建立的另一个高效表达系统。BEVS主要由转移载体、杆状病毒载体和昆虫细胞系三个部分组成。构建重组杆状病毒时，先将外源基因克隆至转移载体，构建成重组转移载体；然后重组转移载体和杆状病毒骨架共转染宿主细胞，将外源片段插入病毒基因组中；再通过特定的筛选标 记和方法获得重组病毒，在昆虫细胞内复制，外源基因得以表达。本研究中，我们将L1基因克隆至pFastBacl质粒中，重组质粒转化携带杆状病毒基因组的大肠杆菌感受态细胞DHIOBac，筛选转座后的阳性重组杆状病毒rBacmid-L1，转染Sf9细胞后获得携带L1基因的重组杆状病毒颗粒，经扩增后感染昆虫细胞，收获L1蛋白。结果表明，HPV18 L1蛋白在昆虫杆状病毒表达系统中获得成功表达。

HPV L1蛋白占病毒外壳主要组成的90%左右，是病毒诱导机体产生特异性中和抗体的主要刺激物，体外表达的L1蛋白具有组装成病毒样颗粒(VLP)的能力。目前上市的HPV疫苗均以L1蛋白为靶抗原。HPV16/18型二价HPV疫苗的L1 VLP通过啤酒酵母细胞产生，酵母表达系统表达外源蛋白水平高，但其糖基化修饰具有局限性。HPV L1蛋白亦可在大肠杆菌中表达，但其缺乏蛋白翻译后的糖基化等修饰加工过程，多数形成包涵体。HPV6/11/16/18型四价HPV疫苗的L1 VLP利用昆虫细胞产生，昆虫细胞不仅培养条件与大肠杆菌及酵母细胞接近，而且细胞易破碎，表达外源蛋白的水平较高，可以进行蛋白翻译后的加工修饰。酵母细胞表达的Ll VLP大小不一，而昆虫细胞表达的LlVLP颗粒相对均一，活性较好。不同于HPV二价疫苗使用的粉纹夜蛾Hi-5昆虫细胞，本研究采用Sf9昆虫细胞，密码子优化后的HPV18 L1基因在Sf9昆虫细胞实现了高水平表达。本研究中，我们以感染rBacmid-L1的Sf9细胞的病毒基因组为模板进行PCR鉴定，证明获得了重组杆状病毒rBacmid-L1；将感染rBacmid-L1的Sf9细胞行免疫荧光检测，可见特异性绿色荧光；Western印迹鉴定在60 000处可见特异性条带，并且仅在细胞沉淀中检测到L1蛋白。因此，利用杆状病毒表达系统，我们成功表达了HPV18 L1蛋白，对新型HPV疫苗的研发具有现实意义。

4[摘要]  目的：利用昆虫杆状病毒系统表达人乳头瘤病毒18型(HPV18)L1蛋白。方法：将L1基因与pFastBacl(pFBI)载体连接，构建转移载体pFBI-L1，转化含Bacmid的大肠杆菌DHlOBac感受态细胞，获得穿梭质粒rBacmid-L1；rBacmid-LI转染Sf9细胞，获得重组病毒rBac-Ll；PCR法检测重组杆状病毒基因组L1基因，间接免疫荧光法和Wc-stern印迹检测L1蛋白的表达。结果：穿梭质粒rBacmid-L1经PCR鉴定构建正确；感染rBac-L1的Sf9细胞经PCR扩增可见1629 bp的特异性条带，间接免疫荧光检测可见绿色荧光，Western印迹鉴定与小鼠抗L1单克隆抗体发生特异性反应，在相对分子质量约60 000处可见特异性条带。结论：利用昆虫杆状病毒表达系统表达了HPV18 11蛋白。