作者：张毅
我们拟构建带GST标签的人β-actin基因质粒，并纯化出CST-β-actin融合蛋白，为进一步研究β-actin的生理功能奠定基础。
1 材料和方法
1.1材料
大肠杆菌DH5a、Rossate感受态，带CST标签的原核表达载体pCEX-KG为本室所有；限制性核酸内切酶、T4 DNA连接酶及PCR试剂购白TaKaRa公司；VigoFect购白威格拉斯生物技术有限公司；质粒提取试剂盒、CST-Sepharose 4B珠子购白Pharmacia公司；PCR产物及酶切载体胶回收试剂盒购自北京天根生物科技有限公司；GST标签鼠单克隆抗体购自Sigma公司；引物由北京赛百盛生物技术有限公司合成；测序由北京博迈得生物技术有限责任公司完成。
1.2vp-actin编码区基因的扩增
从人乳腺基因文库中提取目的基因3-actin，b-actin编码序列引物已由文献报道，利用PCR技术扩增目的基因编码序列。
上游引物为5'-CGGGATCC ATGGATGATCATATCGCCGCGC-3'，
下游引物为5'-CGGAATTCCTACAAGCATTTCJCCGTGGACG-3'。
扩增条件：95℃预变性5 min; 95℃变性30 s，58C退火30 s，72℃ 伸70 s，30个循环；720C再延长5min。用10 g/L琼脂糖凝胶电泳检测PCR产物，用DNA胶回收试剂盒回收日的片段。
1.3 重组质粒的构建及原核表达鉴定
用限制性内切酶BamH I、EcoR I对PCR产物及带CJST标签的载体进行酶切；PCR产物经酶切后直接用DNA胶回收试剂盒回收，酶切载体经DNA胶检测，成功切出后也以同样方法回收；将酶切产物和载体加入含T4DNA连接酶的15μL体系中，于16℃连接仪上连接4h；将连接产物转化大肠杆菌DH5α并涂于氨苄西林抗性LB板上，37℃培育12 h后挑选单克隆并提质粒，再用BamH I、EcoR I双酶切质粒，鉴定正确的质粒送北京博迈得生物公司测序。
1.4 融合蛋白GST-β-actin的小量诱导表达及鉴定
将测序正确的重组质粒转化大肠杆菌Rossate感受态细胞并涂于氨苄西林抗性LB板，37CC孵箱中培育16 h后挑取菌落，接种于氨苄西林抗性LB培养液中，37℃振荡培养4-6 h，至D600nm值为0.6-1.0时，加入IPTG（终浓度为1 mmol/L）进行小量诱导表达。分别收集诱导前后的菌液离心，进行SDS-PAGE和Western印迹检测。
1.5融合蛋白的纯化
挑选小量诱导表达的含GST-B—actin质粒的Rossate菌和含GST空载体的Rossate菌，同时接种于5 mL氨苄西林抗性的LB液体培养基中，于37℃振荡培养约12 h，活化后按2%的比例转接于200 mL氨苄西林抗性的LB液体培养基中，20qC振荡培养至D600nm值为0.4-0.6时，加入IPTG至终浓度为0.1mmol/L，20。C继续培养24 h以上。按Pharmacia公司提供的如下方法纯化蛋白：离心收集菌体，去除上清后向沉淀中加入裂解液并重悬，超声波破碎裂解后12 000 r/min离心收集上清，加入适量GST-Sepha-rose4B纯化珠，于4℃旋转结合4 h后3000 r/min离心收集珠子，缓冲液洗脱未结合的蛋白后得到纯化的融合蛋白，用SDS-PACE鉴定。
2结果
2.1A[3-actin编码区基因的克隆
以人乳腺文库为模板，按前述条件进行扩增，获得约1100 bp的PCR产物（图1）。
2.2 GST-(3-actin重组质粒的构建与鉴定
用BamH I、EcoR 1分别对目的基因片段及带CST标签的载体进行酶切，在T。DNA连接酶的作用下将酶切后的片段及载体进行连接，再转化大肠杆菌DH5α，挑选阳性克隆并提质粒，双酶切后DNA凝胶电泳可见约1100 bp的条带（图2），丽对照GST空载体经双酶切后无此条带，表明人3-actin基因的编码序列已插入带GST标签的载体中。DNA测序结果显示与已知序列一致，无突变发生（数据略）。
2.3 融合蛋白(;ST-(3-actin的小量诱导表达鉴定
将带GST标签的空载体和GST-3-actin重组质粒分别转化大肠杆菌Rossate，挑取克隆并培养，经IPTG小量诱导，收集诱导前后的菌体行Western印迹，表明GST-(3-actin融合蛋白表达正确(图3)。
2.4 融合蛋白GST-β-actin的纯化
利用CJST-Sepharose 4B亲和珠对GST-β-actin进行纯化，SDS-PACE结果显示纯化效果较好，获得一定纯度的GST-3-actin融合蛋白（图4）。
3讨论
在传统意义上，(3-actin被认为是一种结构蛋白，能组成和维持细胞的形态。然而，现在的研究表明，β-actin还是一种信号分子，它是目前已知的所有蛋白中参与蛋闩间联系最多的一种，在高级真核生物中，它至少与100多种不同的β-actin结合蛋白有联系，再加之它在核苷酸水解、离子及大量β-ac-tin结合蛋白作用下能在G-actin与F-actin两种形式间转变的特性，使得β-actin在许多细胞功能中扮演重要角色。目前有研究表明，F-actin在信号传导过程中有重大作用，主要体现在对大量信号通路的控制，如Hippo、Ras-MAPK、Pl3K及NF-KB通路，并日一单体形式的G -actin通过结合到MAL-MRTF转录因子成为信号传导通路中的直接调控物质，这些发现为β-actin在人体中的作用研究开辟了新方向，未来还有更多机理有待探究。β-actin作为细胞骨架的主要组成成分，在细胞与人体内环境的联系中发挥了重要作用。表皮粘着小带是介导细胞间粘连的重要膜蛋白，它在肿瘤细胞的迁移中发挥不可替代的作用，研究发现β-actin可以与前者的胞内区域结合，因此推测β-actin在肿瘤细胞迁移中有极其重要的作用。目前已知，β-actin的不同形式和动力学特征是导致细胞迁移过程中突起形成的重要因素，已有研究发现F-actin与迁移细胞的突起是共存的，它决定了迁移细胞的形态，并且提供细胞与细胞间及细胞与基质间联系时的表皮张力，但其具体作用方式及影响因素仍未知晓。
综上，我们构建了带GST标签的β-actin重组原核表达载体，表达、纯化得到融合蛋白。这有利于进一步探讨β-actin除了作为结构蛋白以外的其他生物分子学方面的功能，也为研究β-actin在肿瘤细胞迁移中的作用奠定了实验学基础。
4[摘要] 目的：构建带CST标签的人β肌动蛋白(b-ac:tin)基因的原核表达产物，纯化出CST-β-actin融合蛋白，为探究β-actin的各项生理功能做准备。方法：以人乳腺文库为模板，利用PCR技术扩增β-actin基因，将其连接到带有GST标签的载体上，经鉴定正确的重组质粒转化大肠杆菌Rossate感受态细胞，小量诱导表达后，利用CST-Sephd-rose 4B亲和珠纯化GST-β-actin融合蛋白，经SDS-PAGE和Western印迹检测。结果：目的基因经PCR技术得以扩增，将其与带GST标签的载体连接后再经双酶切鉴定及测序后确认构建成功；转化大肠杆菌Rossate感受态后获得小量诱导表达，纯化出CST-β-actin融合蛋白，并证实其有生物活性。结论：构建了人b-actin的原核表达载体，并获得了(GST-β-actin融合蛋白。
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