作者：张毅
我们拟构建核输入蛋α/β的真核表达载体，并通过免疫荧光染色技术确定其细胞定位，为进一步研究其生物活性及应用奠定基础。
1 材料和方法
1.1材料
人胚肾293T细胞、pXJ-40-myc载体来自军事医学科学院生物工程研究所；限制性内切酶、DNA连接酶、PCR试剂购自TaKaRa公司；VigoFect购白威格拉斯生物技术有限公司；质粒提取、胶回收、PCR回收试剂盒购白Promega公司；DMEM及小牛血清购自Gibco公司；引物由北京赛百盛基因技术有限公司合成；测序由北京奥科生物技术有限公司完成。
1.2 mvc-Importinn α/β重组质粒的构建与测序
以乳腺癌文库为模板，根据文献报道的核输入蛋白α/β的编码序列14。51合成引物。核输入蛋白α上游引物为5-- CGGGATCCATGTCCACCAACGAGAATGC-3'，下游引物为5'-ATAAGAATGCCGCCGCCTAAAAGTTAAAGGTCCCACC.-3’；核输入蛋白β上游引物为5’-CGGGATCCATGGACJCTCATCACCATTCTCG-3'，下游引物为5’-ATAAGAATCCGGCCGCTCAAGCTTGCJTTCTTCAGTTTC-3’。按以下条件进行PCR扩增：95℃预变性5 min；95℃变性30 s，65℃退火30 s，72℃延伸3.5 min，30个循环；72℃ 7min再延长。用胶回收试剂盒回收PCR产物。
用BamH I /NotI双酶切pXJ-40-myc载体，经10 g/L琼脂糖凝胶电泳后，胶回收载体大片段；将PCR片段回收后再用BamH I lNotI酶切，形成带有与载体相同黏性末端的双链，用T4 DNA连接酶连接人pXJ-40-myc载体，转化大肠杆菌DH5a，挑选克隆，液体培养基振荡培养并提取质粒，用BamH I/Not I双酶切鉴定，鉴定正确的克隆送北京奥科生物技术有限公司测序。
1.3 细胞转染和Western印迹检测
按常规方法进行转染。用含双抗、含100 mL/L胎牛血清的DMEM培养基将293T细胞接种于6 cm皿中，接种量以转染时细胞密度达到80%为宜，培养24 h后进行转染，转染前1 h换液。将4μL Vigo-Fect与200 μL Na1I混合，再将总量为10 μg的重组质粒与200 μL NaCl混合，然后将上述2种溶液轻轻混合，室温放置15 min，加入6 cm皿中，并以同样方法转染空pXJ-40- myc载体作为对照，37℃、5% CO2常规培养，4-6 h换液。质粒转染293T细胞24 h后收集细胞蛋白，加入2xSDS加样缓冲液，煮沸10 min，高速离心2 min，取上清液进行SDS-PAGE后，电转移至硝酸纤维素膜卜；用5%脱脂奶
粉于4℃封闭过夜，加入用5%脱脂奶粉以1：5000稀释的用HRP标记的抗myc标签鼠单克隆抗体，室温轻摇th，TBST洗膜3次，每次5 min；用化学发光法显色5 min，压片显影。
1.4免疫荧光检测
将转染后培养24 h的24孔板从培养箱中取出，1xPBS洗3次；用40 g/L多聚甲醛固定20 min，l×PBS洗3次，每次10 min；加入含0.5% Triton X-IOO和1%羊血清的PBS冰上渗透10 min；用含1%羊血清的PBS封闭30 min，滴加Alexa Fluor 594标记的抗myc-tag抗体(1: 2000)，室温孵育1 h;1xPBS洗3次，每次10 min;用0.1 g/mL DAPI染核，1xPBS洗2次，每次5 min；封片，于荧光显微镜下观察。
2结果
2.1 myc-lmportinα/β重组质粒的构建与鉴定
以本实验室保存的乳腺癌文库为模板，PCR扩增核输入蛋白α/β的编码序列，分别获得约1590和2630 bp的DNA片段，与预期大小一致(图1)。将PCR产物用BamH I /NotI双酶切后，再与经相同酶切的pXJ-40-myc载体连接，转化大肠杆菌DH5α，挑选克隆进行菌液PCR鉴定，初步筛选带有核输入蛋白α/β基因的阳性重组克隆。将所得阳性克隆提质粒，经酶切鉴定均可切出2条长度分别约为5000和1590 bp及5000和2630 bp的条带，符合预期结果（图2）。DNA序列测定结果表明插入片段的DNA序列与核输入蛋白α/β基因的编码序列完全一致（数据略）。
2.2 Western印迹检测myc-lmportin α/β在293T细胞中的表达
将构建的myc-lmportinα/β重组质粒和mvc空载体分别转染293T细胞系，24 h后提取蛋白进行SDS-PACE，Western印迹检测蛋白表达。结果显示，转染重组质粒后，用myc-HRP抗体能够在相对分子质量约62x103和100x 103大小处分别检测到明显的特异性条带，空载体无条带（图3），说明重组蛋白在293T细胞中能够正确表达。
2.3 荧光显微镜观察myc-lmportin α/β在293T细胞中的定位
为了了解核输入蛋白α/β在细胞中的定位，将构建的myc-lmportin α/β重组质粒和空载体分别转染293T细胞系，培养24 h后在显微镜下观察。结果显示，在转染myc-lmportinα重组质粒的293T细胞中，红色荧光在细胞质与细胞核中均有分布；而转染myc-lmportin b重组质粒的293T细胞中，红色荧光主要集中于细胞核。说明myc-核输入蛋白α融合蛋白表达后在293T细胞质与细胞核中均有分布，而myc-核输入蛋白B融合蛋白主要定位于细胞核( 图4 )。
据文献报道，核输入蛋白存在于细胞质中，运送蛋白进入细胞核，而在本实验中通过免疫荧光检测到核输入蛋白α存在于细胞质和细胞核，而核输入蛋白β主要存在于细胞核。我们认为细胞转运所描述的是一个动态过程，而免疫荧光技术是把蛋白固定在了一个时间点再进行检测，另外可能由于实验方法的不同，所以出现了其主要定位于核中的情况。
3讨论
核输入蛋α通过识别和结合靶蛋白的NLS帮助蛋白质人核，是核孔靶向复合物的重要组成部分。其主要分为3个结构单元：未知功能的亲水羧基端、带正电既能结合自身序列中的串联重复模体又能结合核输入蛋白b的结构域(importin p bind-ing doman，IBB)，以及一个大的NI．S中央结合结构域。核输入蛋白α在进化过程中结构和功能上比较保守，如人的6个输入蛋白呈现60%的序列相似性；而核输入蛋白B家族成员在功能上保守，在蛋白质序列上呈现较低的相似性。核输入蛋白β家庭成员相对分子质量为95x103-145x103，结构上都具有保守的N端Ran结合结构域(IBN-N domain)和多个HEAT Repeats结构域。HEAT是由连续重复的37-46个氨基酸残基组成的螺旋形棒状结构单元，而HEAT Repeats是由多个这样的结构域叠加形成的具有延展性的超螺旋，可以通过改变构象以配合结构不同的底物。另外，核输入蛋白β可以使用4种接头蛋白来识别不同类型的底物，从而使得一个受体可以拥有广泛的底物类型，协调了少数受体与大量底物之间的矛盾。大多数核输入蛋白β家族成员可以直接识别底物的NLS并与之结合，而核输入蛋白β1却需要通过与核输入蛋白α的N端IBB结构域结合，借助其作为接头蛋白，从而识别具有经典核定位信号的底物。
核输入蛋白家族成员介导真核细胞核质转运，是核质转运的重要枢纽，也是外来蛋白质进入宿主细胞的有效途径，如一些病毒是通过与核输入蛋白α的结合从而完成入核。Smad-3具有保守的NLS序列，与Smad-4结合形成Smad-3/Smad-4复合物，输入蛋白可识别其NLS序列从而运送其人核，通过Smad- 3/Smad-4的MHI发夹样结构与DNA上的Smads结合元件(smads-binding element，SBE)结合，在其他转录因子的协同作用下调节靶基因的转录，从而实现信号转导。MDM2可以与p53的转录活性结构域结合，抑制p53的转录活性；MDM2也可以通过其自身的NES和NLS序列从胞核向胞质转位，并将p53蛋白移位至胞质中，然后在胞质蛋白酶的作用下p53蛋白被降解，从而使细胞发生抗凋亡而癌变。
蛋白质入核是十分复杂的生物学过程，受到蛋白质磷酸化水平、核转运因子等诸多因素在多个水平上的多重调控，从而使得功能蛋白及其他核蛋白精确分布并正常发挥功能。若蛋白质的核质转运受到干扰，将影响其功能的发挥，最终导致疾病的发生。探明蛋白质的入核机制和调节机制，对研究机体的生命活动，阐明疾病发生、发展机理，以及对新药物的研发都具有重要意义。
