关于短发夹RNA载体稳定抑制端粒相关蛋白TERF2IP1表达的HCT116细胞构建的研究

作者；郑晓敏

   近年有研究报道提示，TERF2IPI作为保守的核蛋白，不仅可以通过与TRF2的结合，在端粒末端发挥抑制同源重组修复和非同源重组修复的作用，还可以通过与胞浆蛋白的结合转位至细胞浆中，参与NF-KB信号通路的活化。同时，TERF2IP1蛋白也可作为转录因子，通过与染色质的非端粒位点的结合，参与下游多种信号通路的调控。为避免短发夹RNA(short hairpin RNA,shRNA)的脱靶效应，提高获得稳定干扰细胞系的成功率，我们设计并合成了分别针对TERF2IP1基因不同位点的4对寡核苷酸序列，克隆至pGP-HI/Hygro载体，瞬时转染结肠癌细胞系，通过抗性筛选，获得稳定低表达TERF2IP1基因的结肠癌HCT116细胞系，为后续研究TERF2IPI蛋白在结肠癌发生发展中的作用提供了技术平台，对研究TERF2IP1在肿瘤进展中的功能具有重要意义。

1  材料和方法

1.1材料

    结肠癌细胞系HCT116及载体pGP-H1/Hygro均由北京大学肿瘤医院暨北京市肿瘤防治研究所实验室保存。

1.2重组质粒的构建

    将合成的TERF2IPl shRNA正义和反义寡核苷酸序列退火形成双链DNA，与经BamH I lllindⅢ双酶切的pGP-H1/Hygro载体混合，用T4DNA连接酶4℃连接过夜，转化大肠杆菌BL21感受态细胞，挑取单克隆菌种进行扩增，并大量提取质粒，质粒送北京华大基因公司测序。

1.3  纯阳性干扰细胞的筛选

    转染前一日将HCT116细胞按5X106/孔铺到6孔板。用LipofectAMINE 2000转染质粒：稀释要转染的质粒4μg到400μL无血清培养基中，同时稀释LipofectAMINE 2000 10 mL到400 mL无血清培养液中，5 min内将质粒和转染液轻轻混合均匀，室温放置30 min；弃去培养液，用无血清DMEM培养液漂洗细胞2次，加上述混合物至六孔板细胞中，继续培养4-6 h，换完全培养基培养；2 d后用400μg/mL的潮霉素筛选抗性克隆，每隔2-3 d换液（含400 mg/mL潮霉素）；12-15 d后细胞克隆开始形成，并有一定的细胞数量，用无菌小滤纸片蘸取消化液，将细胞克隆消化后转移到24孔板中继续培养，在这一过程中，注意不要使各个克隆之间有相互污染；24孔板长满后，消化转移至6孔板中继续培养；6孔板培养4-6 d，将各个细胞克隆消化，其中1/3部分继续培养，剩余2/3部分进行后续检测；将检测为阳性的克隆转到10 cm皿中继续培养，同时冻存保种。

1.4  实时荧光定量RT-PCR检测TERF2IPl mRNA的表达

    为检测shRNA干扰HCT116细胞后TERF2IP1mRNA的表达情况，按TRIzoI说明书提取HCT116-control- shRNA组和HCT116- TERF2IPl- shRNA组细胞的总RNA，反转成cDNA，取1μL cDNA进行PCR扩增。将1 0D的Real-Time PCR上、下游引物分别用TE配成1 mg/mL的储液，37℃溶解，上、下游引物各取1μL混匀稀释至10μL，取1μL进行Re-al-Time PCR反应（94。C初始变性4 min；94C变性30 s，58。C退火30 s，720C延伸30 s，循环40次），最后用2-△△CT对结果进行分析。

1.5     Western印迹检测TERF2IPI的表达

    用本实验室自制的细胞裂解缓冲液[50 mmol/L Tris-Cl(pH7.5). 150 mmol/L NaCI， l% NP-40,0.5%脱氧胆酸钠，0.1% SDS]，新鲜加入蛋白酶抑制剂及DTT，裂解干扰的细胞，4℃、12 000 r/min离心15 min，收取裂解上清作为样品，用BCA法测定样品蛋白浓度，取等量上清液进行SDS-PAGE，将蛋白转移至硝酸纤维素膜上，用含5%脱脂奶粉的PBST液于室温封闭1.5 h，加入TERF2IP1鼠单抗(1:1000稀释)，GAPDH作为内参，4℃反应过夜，PBST洗膜3次，5 min/次，加入HRP标记的羊抗鼠二抗(1: 2000)室温反应45 min，PBST洗膜3次，5 min/次，暗室内用ECL发光法显色5 min，检测日的条带，压片显影定影，以GAPDH作为内参分析结果。

2结果

2.1  TERF2IPl shRNA序列的设计

    根据文献报道的TERF2IP1基因小干扰RNA( siRNA)序列，按照shRNA表达载体的构建原则重新设计TERF2IPl shRNA基因的正义和反义寡核苷酸序列。为提高干扰效率，共设计4对TERF2IP1基因的shRNA序列。TERF2IPI shRNA和对照shRNA序列由北京赛百盛公司合成（表1）。

2.2  重组shRNA质粒载体的测序鉴定

    测序结果显示，对照shRNA和4条TERF2IP1

shRNA序列均已正确插入pGP-H 1/Hygro载体(图1)。

2.3  shRNA干扰HCT116细胞后TERF2IP1基因的表达

    提取转染空载体组和转染干扰序列组的HCT116细胞总RNA，采用实时荧光定量PCR检测各组细胞的TERF21PI相对表达量。结果见图2，转染对照组和转染干扰序列组中可见TERF2IP1基因的阳性表达，TERF2IP1干扰质粒转染组中其表达量明显降低，TERF2IP1基因的表达抑制率分别为43%、27%、17%和53%。

2.4  HCT116细胞的干扰和Western印迹分析TERF2IPI蛋白的抑制效果

    对实时荧光定量PCR检测为有效干扰的单克隆进行扩大培养，提取细胞总蛋白行Western印迹检测，结果如图3。与转染对照相比，转染TERF2IPI -shRNA-1321的细胞中TERF2IPI蛋白的表达抑制率最高为48.6%，转染TERF2IPl- shRNA- 1037和TERF2IPI-shRNA-l l l2后TERF2IPl蛋白的表达抑制率分别为63.1%和73.8%。实验结果表明稳定干扰TERF2IP1基因的HCT116细胞系构建成功。

3讨论

    迄今为止，关于TERF2IPI的功能和机制研究均证实TERF2IPI在维持端粒稳定、抑制基因组不稳定中发挥重要作用，同时在端粒外发挥基因调控的功能。近年研究表明，在乳腺癌细胞中敲低TERF2IPI基因的表达，可以抑制乳腺癌细胞的迁移侵袭。实验证实TERF2IPI与TERF2协同与非端粒位点的DNA结合，参与多通路基因的转录调控，包括细胞骨架调节蛋白、钙离子通道调节蛋白及DNA损伤修复通路。因此，我们可以推测TERF2IP1基因参与人类生理和病理状态下多个过程，探索TERF2IPI在不同疾病尤其是肿瘤中的功能将会成为研究热点。

    RNA干扰(RNAi)技术是通过双链RNA介导同源靶mRNA的特异性降解，导致转录后基因的表达沉默，是一种高效、特异的基因调节技术，最初在1998年的秀丽新小杆线虫研究中被发现。在RNAi技术实际应用中，shRNA/siRNA的适宜作用浓度、最佳作用时间及转染试剂都是影响基因沉默的关键因素，所以实验的稳定性和一致性较难控制。将shRNA靶序列克隆至含H1/U6启动子和真核抗性筛选标签的载体中，进行瞬时转染后的细胞抗性筛选，为获得稳定的特定基因沉默的细胞系提供了有力的实验手段。

HCTI16细胞具有在裸鼠体内成瘤的能力，因此是研究结肠癌发生发展和转移的有力工具。肿瘤的发生发展是一个多因素、多步骤的复杂过程，癌基因的激活是肿瘤发生的始动因素之一，癌基因激活后，除可导致细胞增殖和侵袭能力增强等生物表型外，也可导致染色体结构不稳定进而引起DNA双链断裂等分子表型。因此，研究和探索肿瘤发生和转移过程中的染色体和端粒相关分子事件，一直是研究人员持续关注的热点问题。为了更好地探讨TERF2IPI在结肠癌中的功能和作用，我们根据短发夹RNA的设计原则和要点，设计合成了4对shRNA寡核苷酸序列，克隆至pGP-H1/Hygro载体中，瞬时转染HCT116细胞后，利用潮霉素进行细胞抗性的筛选，获得稳定干扰TERF2IP1基因表达的结肠癌细胞系。实时荧光定量PCR和Western印迹检测结果均提示经潮霉素筛选后稳定干扰了HCTI16细胞中TERF2IP1基因的表达。该细胞模型的建立，为深入研究TERF2IP1基因的功能提供了有效的生物学工具，也为研究TERF2IP1基因与肿瘤的关系提供了技术支持。

4[摘要]  目的：构建针对TERF2IP1基因的短发夹RNA( shRNA)表达载体，在HCT116细胞中鉴定该载体对TERF2IPl基因的干扰效果。方法：设计针对TERF2IP1基因的shRNA序列，将其克隆至p(;PHl/Hygro载体中，瞬时转染HCT116细胞48 l，后，用400 mg/mL的潮霉素筛选抗性克隆，获得阳性单克隆细胞株；分别提取细胞总RNA和蛋白，进行RT-PCR和Western印迹，检测TF. RF2IPl的表达水平。结果：构建了4对针对TERF2IPI基因的shRNA表达载体，通过潮霉素筛选获得稳定干扰TF.RF2IPI基因的HCT116细胞系，实时定量PCR和Western印迹实验均证实潮霉素筛选后，HCT116细胞中TERF2IPI的表达水平明显降低。结论：构建了4对人TERF2IP1基因的shRNA表达载体，获得4株分别针对TERF2IP1基因不同位点的稳定干扰HCrrl16细胞株。