利用超声波辅助提取花生红衣中白藜芦醇的新技术

作者：郑晓敏

    花生含有较丰富的白藜芦醇，因此，研究人员采用不同的提取方法从花生的各个部位都提取到了白藜芦醇，如花生根、花生茎、花生壳、花生藤、花生红衣等。大多以花生根茎、花生梗为提取原料，但是提取花生红衣中的白藜芦醇的报道较少，而花生红衣中白藜芦醇的含量较高，是葡萄中白藜芦醇含量的908倍，且花生红衣食用品质较差，一般加工特别是花生碎生产中又将其作为废料丢弃，造成很大的资源浪费，因此，试验采用超声波辅助响应面法提取花生红衣中白藜芦醇及用HPLC检测其含量，为花生红衣中功能物质的研发及利用提供有力的理论依据。

1  材料与方法

1.1材料与仪器

    花生红衣制备，赣花7号花生在50℃下烘干24 h后经干式脱皮机脱皮，得花生红衣碎片用高速粉碎机粉碎，即得到红衣粉末，过100目筛备用。

    白藜芦醇对照品；甲醇（色谱级）；哇哈哈纯净水；乙醇；75%医用酒精。

    LC-20AT高效液相色谱仪：日本岛津；KQ-100E型数控超声波清洗器：昆山市超声仪器有限公司；LXJ-IIB型离心机：上海安亭科学仪器厂。

1.2色谱条件

    色谱柱，Inertsil ODS-3( 4.6 mm×250 mm．5μm)；流动相：甲醇一水( 44：55，V/V)；流速1mL/min；柱温24℃；检测波长306 nm。

    对照品制备：精确称取白藜芦醇标准品5 mg，用50 mL甲醇定容成100pg/mL的储备液，然后从中分别取0，0.2，0.4，0.6，0.8和1.0 mL置于10 mL的容量瓶中，并用甲醇定容到10 mL。

1.3  白藜芦醇标准曲线

    将制备的对照品经微孔滤膜过滤后上高效液相色谱，测定其峰面积，得到线性方程为Y=148 0lOX-25 139（R2=0.999 7）

    其中，X-质量浓度；Y-不同浓度下的相应峰面积。可以得出此曲线在一定范围内的线性关系良好。

1.4提取方法

    以不同提取时间、提取温度、溶剂浓度和液料比值等进行单因素试验。花生红衣粉末经过石油醚脱脂处理，烘干，称取适量加入一定量的不同浓度的提取溶剂，震荡混匀，超声提取仪中调节不同温度提取一定的时间，取滤液离心，过0.22 μm微孔滤膜，然后上液相色谱仪测定其含量，每次试验重复3次，结果取平均值。

2结果与分析

2.1  提取温度对花生红衣中白藜芦醇提取物的影响

    液料比值为15 mL/g，提取溶剂浓度为75%，提取时间为50 min，提取温度分别为30℃，40℃，50℃，60 ℃．70℃和80℃，得到的白藜芦醇含量如图l所示。

    从图1中可以得出提取温度对花生红衣中白藜芦醇的提取含量影响还是很大的，花生红衣中白藜芦醇的提取含量先是随温度的增加而增加，在50℃后随温度的增加而降低。根据布朗运动，温度升高，组织内的分子运动也加剧，扩散和渗透速度也加快，花生红衣中白藜芦醇也更快地扩散到溶剂中，所以花生红衣中白藜芦醇的浸出量随着温度的升高也逐渐增加；

但当温度超过50 oC时，花生红衣中白藜芦醇的浸出量反而下降，这是由于温度过高，浸提溶剂挥发严重，导致其提取效果下降，且由于白藜芦醇对于温度比较敏感，过高的温度会导致白藜芦醇丧失生理活性。因此，提取温度选择50℃最佳。

2.2提取时间对花生红衣中白藜芦醇提取物的影响

提取温度为50 0C，液料比值为15 mL/g，提取溶剂浓度为75%，提取时间分别为30，40，50，60，70和80 min，得到花生红衣中白藜芦醇的含量如图2所示。

    按理论设想，时间的适当延长可以使提取更加的充分，提取量也会增加，试验结果也验证了设想，随着时间的延长，花生红衣中白藜芦醇的含量逐渐增加，但是当时间增加到60 min时，再增大时间则提取率出现下降，由于白藜芦醇本身是一性种活性抗氧化物质，可能是由于在一定温度下，随着时间延长，其氧化的消耗量大于新提取出的量，导致提取率出现下降；亦或是随着时间延长，热量累计导致对温度敏感的白藜芦醇出现分解，具体原因还需要具体试验论证。因此，提取时间选择50 min最佳。

2.3液料比值对花生红衣中白藜芦醇提取物的影响

提取温度为50℃，提取时间为50 min，提取溶剂浓度为75%，分别设置9，11，13，15，17和19 mL/g等6个不同液料比值的试样进行超声提取，得到花生红衣中白藜芦醇的含量如图3所示。

    从图中可以看出，随着液料比值变化，白藜芦醇含量也随之变化，呈现先增加后减小的趋势，液料比值在9～15mL/g时，随着浸提溶剂量的增加，花生红衣中白藜芦醇含量也随之增加，这是由于当样品量一定时，增加溶剂量有利于原料中有效成分向浸提液中扩散，则白藜芦醇的浸出率增加；当浸提溶剂增加到一定量时，原料中的有效成分大多已经溶解在浸提液中了，所以再增加浸提溶剂量，白藜芦醇的浸出率也不再增加，因此，液料比值在15—19 mL/g时，白藜芦醇的浸出率反而降低。综合考虑提取率和经济效益的影响，液料比值为15 mL/g为宜。

2.4提取溶剂体积分数对花生红衣中白藜芦醇提取物的影响

    提取温度为50℃，提取时间为50 min，液料比值为15 mL/g，分别取乙醇体积分数为50%，60%，75%，80%，90%和100%的样品超声提取，得到花生红衣中白藜芦醇的含量如图4所示。

如图4可以看出，采用不同体积分数的溶剂提取花生红衣中白藜芦醇的含量变化趋势缓慢，当溶剂体积分数为80%时白藜芦醇含量最高。综合考虑提取率和经济效益的影响，溶剂体积分数为75%为宜。

2.5  Box-Behnken试验设计及试验结果分析

根据液料比值、提取时间和提取温度三个单因素试验结果，选出以上因素的最佳水平作为中心试验点，采用Box-Behnken试验设计分析液料比值、提取时间和提取温度对白藜芦醇含量的影响，具体因素水平安排见表1。

利用Design-Expert 8.0.6软件设计试验方案；具体Box-Behnken组合设计结构矩阵及试验结果见表2。

2.5.1  回归方程的建立及显著性

    试验设计与结果见表2，采用Design-Expert 8.0.6对试验结果进行回归分析，得到白藜芦醇含量(Y)与液料比值(X1)、提取时间（X2）和提取温度（X3）编码值的二次回归方程为：

    Y=18.39+0.53X1-0.39X2-0.36X3+0.30XIX2-0.050X1 X3-0.3 8X2X3 -0.62X12_1. 87X22-0.77X32

    同时白藜芦醇含量(Y)与液料比值(Xl)、提取时间（X2）和提取温度（X3）模型的决定系数R2=0.994 8．R2Adj=0.988 2，说明该模型能解释98.83%响应值的变化，与实际试验拟合良好，试验误差小，证明应用Box-Behnken组合设计试验优化液料比值、提取时间和提取温度对白藜芦醇含量的影响具有一定的实际意义。

    从表3中可以得出白藜芦醇含量与液料比值、提取时间和提取温度的模型F=150.113 5，对应的p <0.000 1，说明该模型极显著，从表3还可以得出液料比值（X1）、提取时间（X2）、提取温度（X3）、液料比值（X1）与提取时间（X2）交互作用及提取时间（X2）与提取温度（X3）的交互作用对白藜芦醇含量影响达到了极显著水平(p<0.01)。失拟项p=0.246 4>0.05．说明所建立的二次模型能较好地拟合液料比值（X1）、提取时间（X2）和提取温度（X3）与白藜芦醇含量的关系，可以采用此模型优化提取工艺条件以达到提高白藜芦醇含量的目的。对白

藜芦醇含量的影响因素顺序依次为：液料比值>提取时间>提取温度。

从表3可得出，XIX2( p=0.003 6<0.01)和X2X3( p=0.000 9<0.01)交互作用显著，采用降维分析法，在其它因素条件固定不变情况下，某两个因素对白藜芦醇含量的影响，即液料比值和提取时间交互作用及提取时间和提取温度的交互作用对白藜芦醇含量的影响。图5和图6是Design-Expert 8.0.6软件做出的等高线图及响应曲面图，对这些因素中交互项之间的交互效应进行分析。

    由图5可知提取温度固定为50℃，液料比值在较低水平时，白藜芦醇含量随着提取时间先升高后降低，液料比值对白藜芦醇含量的影响起主要作用；由图6可知，液料比值固定为14 mL/g，提取温度在较低水平时，白藜芦醇含量随着提取时间线升高后降低，提取时间对白藜芦醇含量的影响起主要作用。

2.5.2提取工艺条件的优化

    分析液料比值、提取时间和提取温度与白藜芦醇含量的二次回归数学模型，以得到最佳提取工艺条件：液料比值为14.96 mL/g，提取时间为63.60 min，提取温度为49.56℃；此条件下白藜芦醇含量的理论值为18.511 1μg/g。

2.5.3验证性试验

  按优化的提取条件并结合实际情况进行验证性试验，取液料比值为15 mL/g，制提取时间为64 min，提取温度为50℃，三次试验测定得到的白藜芦醇的平均含量为18.178 5μg/g。

3结论

对花生红衣采用超声波辅助法提取白藜芦醇，在单因素试验基础上将响应面法应用到花生红衣中白藜芦醇的提取。结果表明，提取时间、提取温度及料液比对白藜芦醇提取率的影响较大，且不是单一的线性关系。通过回归分析和验证试验结果表明此方法是合理可行的，且花生红衣中白藜芦醇最佳的提取工艺为液料比值15.0 mL/g，提取时间64.0 min，提取温度50℃，溶剂体积分数75%，最终试验值与理论预测值相接近，在此条件下，白藜芦醇含量为18.178 5μg/g。

4摘要

 为优化超声波提取花生红衣中白藜芦醇的提取工艺，在单因素试验基础上，采用Box-Behnken试验设计分析得出了提取温度、液料比值及提取时间对花生红衣中白藜芦醇的得率有较大的影响，并以白藜芦醇的得率为响应值，得到其最佳提取工艺为：液料比值14.96 mL/g，提取时间63.60 min，提取温度49.56℃，溶剂体积分数75%,与模型预测值相符合。