理论与实践: HADH酶法区分解冻虾与新鲜虾方法

    作者：郑晓敏

    目前区分解冻肉与新鲜肉的方法包括酶DNA检测法、波谱检测法、生物成像法和酶法检测。利用卫星测定方法可以检测新鲜鸡肉的DNA状态，并可了解微生物污染情况，是一种快捷便宜的方法。波谱法研究主要采用近红外光谱法对肉品进行观察研究，在肉品的存贮过程中，脱氧肌红蛋白、高铁肌红蛋白和氧合肌红蛋白会发生不同的变化，科学家利用光谱手段对各种肉品进行考察，试图找出区分新鲜肉／解冻肉的方法。生物成像法则通过显微镜成像或扫描电镜成像等方法直接观察肉品细胞的微观结构，根据样本微观结构与新鲜肉品的差异，判定是否曾经存在冰晶，进而判别是否为解冻肉品。HADH酶活鉴别动物组织是否经过冷冻处理的方法，由于该方法的有效性及商业价值，在上世纪90年代后许多学者对其进行了深入的研究。已经公布的研究对象范围多集中在水产品、蛙肉组织等，发现至昏处理或碎冰保存的加工方式不能改变牛蛙腿肉HADH酶活，而冷冻处理则明显影响其HADH酶活。由于国内外养殖方法、地域和样品种类等存在差异，不能简单根据文献中酶活值高低判断样品是否经过冷冻。因此，试验以对虾和虾姑为研究对象，建立根据HADH酶活值高低判别新鲜虾与解冻虾的方法，为如何判别新鲜水产品与解冻水产品提供参考，为进一步的深入研究提供理论依据。

1  材料与方法

1.1试验材料与仪器

    新鲜活对虾、新鲜活虾姑：市售；NADH、EDTA、Acetoacetyl-CoA标准品：购于美国Sigma公司；其它试剂均为常规试剂。

    BS223S电子分析天平：赛多利斯科学仪器（北京）有限公司；冰箱：美的公司；紫外一可见分光光度、1 mL比色杯：尤尼科（上海）仪器有限公司。

1.2溶液配制

1.2.1磷酸盐缓冲溶液

    将13.8 g磷酸二氢钠加水溶解并定容至0.1 L，得1 mol/L的Na2HPO4溶液；将14.2 g磷酸氢二钠加水溶解并定容至0.1 L，得1 mol/L Na2HPO4溶液。将13.8 mL的1 mol/L的磷酸氢二钠与87.7 mL的1 moI/L的磷酸二氢钠溶液混合，加水定容至1L制得磷酸盐缓冲液。

1.2.2 EDTA配置

    将1 040 uL浓度为0.5 mol/L的EDTA溶于14 000uL的水中，配得34.4 mmol/L的EDTA溶液。

1.2.3  NADH配置

    称取0.106 g NADH粉末加水定容至100 mL配得浓度为1.5 mmol/L的NAHD溶液。

1.2.4双乙酰辅酶A配置

    将8 mg的双乙酰辅酶A(Acetoacetyl-CoA)溶于1600 uL水中，配得5.9 mmol/L双乙酰辅酶A溶液。1.3试验原理

    B-羟基辅酶A脱氢酶（HADH酶）是一种广泛存在于动物细胞中的线粒体酶。在冷冻过程中，虾肉组织里的自由水冻结形成小冰晶，解冻过程中，小冰晶聚集成大冰晶，使细胞遭到破坏，HADH酶随之释放出来，因此解冻肉的HADH酶活理论上高于新鲜肉，通过测定HADH酶活可以区分解冻肉与新鲜肉。在室温( 25 0C)、pH 6的条件下,B-羟基辅酶A脱氢酶( HADH)在双乙酰辅酶A(Acetoacetyl-CoA)的协同作用下，使底物烟酰胺腺嘌呤二核苷酸( NADH) 脱氢生成NAD+。

    其反应过程为：

                       HADH

  Acetoacetyl-CoA+NADH+H+->B-hydroxyacyl-CoA+NAD+

    HADH酶作为催化剂作用于NADH脱氢过程，HADH酶活力决定了反应速度。反过来，通过观察反应速度可判断HAHD酶活，该试验就是通过检测反应速度来推算样本提取液中的HADH酶活。而反应速度可通过NADH（反应物）的减少速率或NAD+（生成物）的增加速率判断，反应物NADH在340 nm处有最大吸光度，因此HADH酶活高低可通过NADH在340

 nm处吸光度的下降速率判断。

1.4试验方法

    试验方法为：向样品中加入10 mL浓度为0.1 mol/L磷酸盐缓冲盐溶液(pH 6)，使样品充分浸润，静置15 min后用0.22 um水膜过滤，取15uL 滤液加入600uL 磷酸盐缓冲液中，向该体系中加入47 uL的浓度为34.4 mmol/L EDTA溶液，反应3min后加入27uLNADH( 1.5 mmol/L)和10uL的浓度为5.9 mmol/L Acetoacetyl-CoA，混合均匀后立即在340 nm处测定吸光度A0，每隔10 s读取一次吸光度，记录前250 s的吸光度。该试验在常温下进行。

    用所测定的吸光度( ABS)为纵坐标，测定时间( min)为横坐标作图，得到斜率(Slope)，HADH酶活值用公式(1)计算：

    HADH=- 104×Slope    (1)

1.5试验内容

1.5.1  新鲜对虾（或虾姑）与解冻对虾（或虾姑）HADH酶活值分析

    取新鲜的30只对虾和30只虾姑进行放于4 0C保藏3h后进行HADH酶活测定，取另外新鲜的30只对虾和30只虾姑放于-18℃冷冻12 h，之后放于40C保藏3h进行HADH酶活测定。分析时去掉外壳，去掉头等部位，只留虾仁。分别测定新鲜对虾（或虾姑）与解冻对虾（或虾姑）的HADH酶活值，每组3只，共10组。

1.5.2判别分析方法的建立

    将新鲜对虾（或虾姑）与解冻对虾（或虾姑）的HADH酶活值分析结果置入SPSS19.0，通过对比其酶活，建立判别分析方法。然后根据显著性分析结果确定新鲜对虾（或虾姑）与解冻对虾（或虾姑）的HADH酶活判别阈值。

1.5.3新酶活阈值的检验

    各取10组经加密后的对虾和虾姑作为检测对象分析新的酶活阈值是否准确，每组共3个样品。

1.6统计学方法

    判别分析采用Fisher判别分析法，步进方式进行归类，差异性显著性分析用SPSS 19.0( IBM)分析，显著性分析假设齐方差，判断方法为Duncan多重比较法或Levene比较法。将95%的置信区间加减0.5倍标准偏差作为新的判别阈值，并根据新的HADH酶活阈值判别经加密的样品确定该方法的准确性。

2结果与分析

2.1新鲜对虾（或虾姑）与解冻对虾（或虾姑）HADH酶活值差异分析结果

2.1.1  新鲜对虾与解冻对虾HADH酶活值差异分析结果

    分别将新鲜对虾和解冻对虾按照方法1.4进行HADH酶活值测定，如表1所示。

    通过对表1观察得知，新鲜对虾HADH酶活均值为56，标准偏差为28，95%置信区间为44～85，样品中HADH酶活值最低为24，最高酶活值为102；解冻对虾HADH酶活均值为1 1 1，标准偏差为37，95%置信区间为84~138，样品中HADH酶活值最低为67，最高为163。新鲜对虾与解冻对虾HADH酶活值具有显著性差异。

2.1.2新鲜虾姑与解冻虾姑HADH酶活值差异分析结果

    将新鲜虾姑和解冻虾姑分为两组，按照方法1.4分析其HADH酶活值，结果如表2所示。

    表2结果显示，新鲜虾姑HADH酶活均值为49，标准偏差为19，95%置信区间为35～63，样品中HADH酶活值最低为23，最高酶活值为76；解冻虾姑HADH酶活均值为295，标准偏差为59，95%置信区间为253，均值337，样品中HADH酶活值最低为225，最高为387。表2统计学结果说明，新鲜虾姑与解冻虾姑具有极显著差异，p <0.001。该结果与前人研究结果类似，发现新鲜对虾HADH酶活值为10.8，解冻对虾HADH酶活值为75，两组结果具有极显著差异，新鲜牛蛙后腿与解冻牛蛙后腿HADH酶活值有极显著性差异。

2.2  新鲜对虾（或虾姑）与解冻对虾（或虾姑）HADH酶活值判别分析结果

2.2.1  新鲜对虾与解冻对虾HADH酶活值判别分析结果

    为快速判别冷鲜对虾样品是否经过冷冻，建立区分新鲜对虾与解冻对虾的判别分析方法，采用Fisher函数和组内相关矩阵分析发现，虽然新鲜对虾与解冻对虾HADH酶活值具有显著性差异，但新鲜对虾有3组HADH酶活值高于新鲜样品与解冻样品阈值，解冻对虾有4组HADH酶活值低于新鲜样品与解冻样品阈值。结果如表3所示。

    为方便判别，将新鲜对虾与解冻对虾得到的数据分布看成正态分布，然后重新确定新鲜对虾与解冻对虾的HADH酶活阈值。将判别结果结合显著性结果，新鲜对虾HADH酶活值95%置信区间为44~85，将上限85减0.5倍的标准偏差值为71，根据正态分布曲线，从负无穷积分至71涵盖总数据量的60%以上；解冻对虾HADH酶活值95%置信区间为84～138，将下限84加0.5倍的标准偏差为102，根据正态分布曲线，从102积分至正无穷涵盖解冻对虾HADH酶活值总数据量的60%以上。根据正态分布结果，重新建立根据HADH酶活值判断新鲜对虾与解冻对虾来源的阈值，即当未知样品的HADH酶活值小于71时，该来源的样品为新鲜对虾，当HADH酶活值大于102时，该来源的样品为解冻对虾，当HADH酶活值介于71～102之间时，需重新判断样品的来源。

2.2.2新鲜虾姑与解冻虾姑HADH酶活值判别分析结果

    根据表2结果显示，新鲜虾姑HADH酶活最高值为76，解冻虾姑HADH酶活最低为225。新鲜虾姑与解冻虾姑判别分析如表4所示。

    根据表4得知，所有的样品均得到正确的分类，结合正态曲线分布结果，可简单根据新鲜虾姑与解冻虾姑HADH酶活值进行判断，即当虾姑HADH酶活值低于76为新鲜虾姑，当虾姑HADH酶活值高于225为解冻虾姑，当HADH酶活值介于76和225之间时，需重新

判断。

2.3新鲜对虾（或虾姑）与解冻对虾（或虾姑）再测样本分析

    将得到的新阈值再次判断经加密的10组样品，每组3个样品，将结果代人新的判别阈值如表5所示。表5结果显示，该判断结果准确率100%，其中有1组对虾HADH酶活均值介于71～102之间，有1组虾姑HADH酶活均值介于76和225之间，需重新判断（对虾和虾姑均相同，见表5）。

3结论

以对虾和虾姑为研究对象，建立根据HADH酶法区分新鲜对虾与解冻对虾、新鲜虾姑与解冻虾姑的方法，并根据统计学结果可快速判别未知样品是否经过冷冻。当对虾样品HADH酶活值小于71时为新鲜样品，大于102时为解冻样品，介于两者之间时需重新判断；当虾姑HADH酶活值低于76为新鲜样品，大于225为解冻样品，介于两者之间时需重新判断。试验结果准确度高达100%，且设备简单、试验操作简便，为判断新鲜对虾与解冻对虾、新鲜虾姑与解冻虾姑提供参考，为进一步的深入研究提供理论依据。

4摘要

为快速区分新鲜对虾（或虾姑）与解冻对虾（或虾姑），以放置在4℃的新鲜对虾与新鲜虾姑以及放置-18℃经4℃解冻的解冻对虾与解冻虾姑为原料，建立根据HADH酶法快速区分新鲜样品与解冻样品的方法，并根据统计学结果分类未知样品。研究结果显示，新鲜对虾与解冻对虾HADH酶活均值分别为65和111，新鲜虾姑与解冻虾姑HADH酶活均值分别为49和295，且新鲜对虾（或新鲜虾姑）与解冻对虾（或解冻虾姑）HADH酶活具有显著性差异，新鲜虾姑与解冻虾姑HADH酶活值具有显著性差异。显著性结果结合判别结果显示，当对虾样品HADH酶活值小于71时为新鲜样品，大于102时为解冻样品，介于两者之间时需重新判断；当虾姑样品HADH酶活值低于76为新鲜样品，大于225为解冻样品，介于两者之间时需重新判断。该方法的准确率高达100%，该研究结果为判断新鲜海产品与解冻海产品提供直接参照。