思考与探索:川明参皂苷的大孔树脂纯化及其抑菌性研究

作者：郑晓敏

    目前，对川明参的研究主要集中在主要营养成分分析、多糖和香豆素提取等。试验研究川明参皂苷的大孔树脂纯化及其抑菌性，以期为川明参的推广和皂苷资源的挖掘提供另一途径。

1材料及方法

1.1原料与试剂

    川明参：四川省苍溪县龙山川明参合作社提供；D-301、D-101树脂：郑州勤实科技有限公司；X-5、AB-8、HPD-600、NKA-9、D-4020树脂：上海华蓝化学科技有限公司。

  皂苷标准品：上海永叶生物科技有限公司；乙醇、甲醇、HC1、NaOH、硫酸、石油醚、香草醛、冰乙酸等：实验室提供。

1.2试验仪器与设备

    HK-02型小型中药粉碎机：湖南中诚制药机械厂；FA1004型电子天平：郑州华通实业有限公司；R5003旋转蒸发仪：天津鑫源仪器仪表有限公司；754型紫外分光光度计：上海谱元仪器有限公司；FDGJ-0.5C型真空冷冻干燥机：南京玛尔仪器设备有限公司。

1.3试验方法

1.3.1大孔树脂的预处理

    大孔吸附树脂→体积分数为95%乙醇浸泡溶胀→装柱→体积分数为95%乙醇洗至流出液加水(1:5，V/V)不混浊→蒸馏水洗至无醇味→5% HC1溶液浸泡→ HC1溶液洗涤→蒸馏水洗至中性→2%NaOH溶液浸泡→2% NaOH溶液洗涤→蒸馏水洗至中性→抽滤→置于密闭容器备用

1.3.2川明参皂苷的提取与纯化工艺流程

    川明参→洗净→粉碎→过筛→加体积分数为50%乙醇超声提取3次→过滤→合并滤液→蒸干→加无水甲醇溶解→加15%硫酸回流→冷却→石油醚萃取3次→合并萃取液→旋转蒸发→甲醇→水（70：30，V/V）溶解→定容→精密吸取川明参供试液→上柱→大孔树脂吸附→乙醇洗脱→收集→减压浓缩→冷冻干燥→川明参皂苷

1.3.3川明参皂苷的测定

    采用香草醛一冰乙酸比色法标准溶液配制：准确称取花旗参皂苷标准品50.0 mg置于100 mL容量瓶中，溶解。分别取花旗参皂苷标准溶液0.1，0.3，0.6，1.0，1.8，2.4 mL于6只100 mL容量瓶中，定容。测定系列标准溶液的吸光度。经统计回归处理，得到线性方程为y=0.091 3x-0.076 3．R2=0.999 7，x指标准品的质量浓度( mg/mL)，y指吸光度。

    样品测定：准确移取一定量的样品溶液于容量瓶中，加3 mL 5%香草醛一冰乙酸溶液和1.0 mL高氯酸溶液作显色液，摇匀，静置。以空白试剂作参比，在590 nm波长处测其吸光度。

    川明参皂苷纯度=P1／W1×100%    (1)

    式中：P1-大孔树脂吸附后皂苷质量，g；Wl-供试液中皂苷质量，g。

1.3.4大孔树脂种类的选择

    分别选取X-5、AB-8、D-301、D-101、HPD-600、NKA-9、D-4020大孔树脂纯化川明参皂苷，在上样液质量浓度为0.4 g/mL、吸附流速为2 BV/h条件下，50%乙醇保持洗脱流速为4 BV/h进行洗脱，收集，减压浓缩，冷冻干燥，得到川明参皂苷。以皂苷纯度为指标，确定大孔树脂的种类。

1.3.5川明参皂苷的大孔树脂纯化工艺优化

    根据单因素试验，选取上样液浓度、吸附流速、乙醇体积分数、洗脱流速四个因素的最优试验范围，以皂苷纯度作为优化指标，采用正交试验对川明参皂苷的的纯化条件进行优化。

1.3.6最小抑菌浓度(MIC)的测定

    将川明参皂苷溶液和液体培养基配成质量浓度分别为100, 50, 25，12.5，6.25，3.125和1.56 g/L液体，对照组设为空白。把25 VL菌悬液加进试管，经过一段时间培养后，取出观察，以浓度低而无肉眼可见菌生长的一管浓度为川明参皂苷对该菌的MIC。

1.3.7最小杀菌浓度(MBC)的测定

    从1.3.6最小抑菌浓度(MIC)试验结果为“一”的试管中，用微量移液器各移取0.3 mL于牛肉膏蛋白胨培养基上，灭菌涂布棒推开，每一试管铺3个平皿以设置重复试验，之后在37℃下培养48 h，观察结果。以培养基表面仍无细菌生长的最小药物浓度为川明参皂苷对该菌的MBC。

2结果与分析

2.1大孔树脂种类的选择

大孔树脂的吸附性能主要取决于吸附剂的表面性质，即树脂的极性功能基和空间结构、孔径比表面积。由图1可知，选择Dl01大孔树脂时，皂苷纯度较高，比用其他大孔树脂的效果好。

2.2川明参皂苷的大孔树脂纯化工

2.2.1上样液浓度对川明参皂苷纯化效果的影响

  设定大孔树脂纯化川明参皂苷时，吸附流速为3 BV/h．乙醇体积分数为60010，洗脱流速为4 BV/h，分别在上样液质量浓度为0.2，0.4，0.6，0.8，1.0，1.2和1.4 g/mL七个梯度下，按1.3.2纯化川明参皂苷并计算其纯度。由图2可知，当上样液质量浓度为0.6 g／mL，川明参皂苷纯化效果较好。

2.2.2吸附流速对川明参皂苷纯化效果的影响

    设定大孔树脂纯化川明参皂苷时，上样液质量浓度为0.6 g/mL，乙醇体积分数为60%，洗脱流速为4BV/h，分别在吸附流速为1，2，3，4，5，6和7 BV/h六个梯度下，按1.3.2纯化川明参皂苷并计算其纯度。由图3可知，当吸附流速为3 BV/h时，川明参皂苷纯化

效果较好。

2.2.3  乙醇体积分数对川明参皂苷纯化效果的影响

设定大孔树脂纯化川明参皂苷时，上样液浓度为0.6 g/mL，吸附流速为3 BV/h，洗脱流速为4 BV/h，分别在乙醇体积分数为20%，300/0，40%．50%，60%，70%和80%七个梯度下，按1.3.2纯化川明参皂苷并计算其纯度。由图4可知，当乙醇体积分数为60%时，川明参皂苷纯化效果较好。

2.2.4洗脱流速对川明参皂苷纯化效果的影响

    设定大孔树脂纯化川明参皂苷时，上样液质量浓度为0.6 g/mL，吸附流速为3 BV/h，乙醇体积分数为60%，分别在洗脱流速为2，3，4，5，6，7和8 BV/h七个梯度下，按1.3.2纯化川明参皂苷并计算其纯度。由图5可以看出，当洗脱流速为5 BV/h时，川明参皂苷纯化效果较好。

2.2.5川明参皂苷的大孑L树脂纯化的优化试验

分别选取上样液质量浓度为0.4，0.6和0.8 g/mL，吸附流速为2，3和4 BV/h，乙醇体积分数为50%，60%和70%，洗脱流速为4，5和6 BV/h利用正交试验优化大孔树脂纯化川明参皂苷的最佳条件。因素水平见表1，结果见表2。

    由表2可以看出，大孔树脂纯化川明参皂苷各因素的主次顺序为A>B>D>C，即：上样液浓度>吸附流速>洗脱流速>乙醇体积分数。大孔树脂纯化川明参皂苷的工艺条件最优组合为A2B2C3D1，即：上样液质量浓度为0.6 g/mL，吸附流速为3 BV/h，乙醇体积分数为70%，洗脱流速为4 BV/h，此条件下大孔树脂纯化川明参皂苷纯度为94.215%。

2．3川明参皂苷的抑菌性研究

2.3.1  川明参皂苷对供试菌的最小抑菌浓度(MIC)测定

  川明参皂苷对供试菌的MIC测定结果见表3。从表中结果可以看出，川明参皂苷对沙门氏菌、金黄色葡萄球菌和大肠杆菌的MIC为6.25%，对根霉和酿酒酵母的MIC为12.5%，对枯草芽孢杆菌和黑曲霉的MIC为25%。由此可知，川明参皂苷对供试菌有较强的抑制作用。

2.3.2川明参皂苷对供试菌的最小杀菌浓度(MBC)的测定

    川明参皂苷对供试菌的MBC测定结果见表4。从表中结果可以看出，川明参皂苷对沙门氏菌、金黄色葡萄球菌和根霉的MBC为12.5%，对大肠杆菌和酿酒酵母的MBC为25%，对枯草芽孢杆菌和黑曲霉的MBC为50%。由此可知，川明参皂苷有较强的杀菌作用。

3结论

    选用Dl01大孔树脂纯化川明参皂苷。川明参皂苷的大孔树脂纯化的最佳工艺条件，即上样液质量浓度为0.6 g/mL，吸附流速为3 BV/h，洗脱剂为体积分数70%乙醇，洗脱流速为4 BV/h，此条件下大孔树脂纯化川明参皂苷纯度为94.21%。

川明参皂苷具有较好的抑菌活性，对细菌、霉菌和酿酒酵母都有很强的抑制效果。川明参皂苷对沙门氏菌、金黄色葡萄球菌和大肠杆菌的MIC为6.25%，对根霉和酿酒酵母的MIC为12.5%，对枯草芽孢杆菌和黑曲霉的MIC为25%；对枯草芽孢杆菌和黑曲霉的MBC为50%。

4摘要

试验主要研究了川明参皂苷的大孔树脂纯化工艺及其抑菌性。以皂苷纯度为指标，选用D101大孔树脂纯化川明参皂苷。通过正交试验确定川明参皂苷的大孔树脂纯化的最佳工艺条件，即上样液质量浓度为o．6 g/mL，吸附流速为3 BV/h，洗脱剂为体积分数为70%乙醇，洗脱流速为4 BV/h，此条件下大孔树脂纯化川明参皂苷纯度为94.21%。川明参皂苷具有较强的抑茵活性。其中，对沙门氏菌、金黄色葡萄球菌和大肠杆菌的MIC为6.25%，对根霉

和酿酒酵母的MIC为12.5%，对枯草芽孢杆菌和黑曲霉的MIC为25%;对枯草芽孢杆菌和黑曲霉的MIC为50%。