作者：郑晓敏
衰老通常指机体生长发育成熟之后，机体的生理功能逐渐下降，组织器官逐渐发生退行性的改变，最后走向死亡的过程 [1]。自由基是对核酸、蛋白质、糖类以及生物膜造成伤害导致机体损伤[1]，其中超氧阴离子自由基、脂质过氧化自由基和羟基自由基是导致人体衰老的主要自由基[2]，保持机体合适水平的自由基清除剂和抗氧化剂能够推迟衰老。我国提前进入老龄化社会，研究表明，自由基可以引发老年退行性疾病（帕金森病、心脑血管病、老年痴呆症、中风等），天然抗氧化剂对老年退行性疾病具有预防和治疗作用[3]。目前对天然抗氧化剂的研究较多，比如白藜芦醇[4]、茶多酚[5]、银杏叶提取物等[6]，而富含多种生物活性成分的植物精油为研究、开发天然抗氧化剂提供了充足的原料。沙漠果作为新疆的特色干果，其营养丰富，含油量达到67%m，含有多种生物活性物质，其不饱和脂肪酸达到70%以上，是一种新型的保健食用油。研究沙漠果油的抗氧化活性，开发新的天然抗氧化剂，充分利用新疆资源，促进新疆特色产业的发展。
，目的是在损失很少信息的基础上简化数据和揭示变量之间的关系[8-9]。对富含多种生物活性的沙漠果油体外抗氧化的基础上，结合PCA方法预测其活性物质单体和抗氧化之间的相关性，确定体外抗氧化的关键物质。试验在研究沙漠果油提取方法的基础上，分别采用索式法、超声波法、水酶法、水代法、回流法从新疆沙漠果中提取沙漠果油，使用GC-MS测定不同沙漠果油样本脂肪酸和甾醇类物质的组成。研究不同沙果油样本的体外抗氧化能力，分别测定DPPH自由基、ABTS+自由基、超氧阴离子自由基和羟基自由基的清除能力，并通过PCA分析沙漠果油脂肪酸、甾醇与抗氧化活性的相关性。旨在为新疆沙漠果功能性产品开发提供理论依据，增加沙漠果的产品的多样性。
1 材料与方法
1.1材料、仪器与设备
沙漠果，新疆石河子市农贸市场。
DPPH．：上海源叶生物科技有限公司；ABTS:合肥博美生物科技有限责任公司；石油醚（分析纯，沸程30℃～60℃），无水乙醇、过硫酸钾、甲醇、tris、邻苯三酚、邻二氮菲、磷酸二氢钾、磷酸氢二钾、硫酸亚铁、过氧化氢、乙醚、碳酸钠、正己烷、吡啶、乙酸酐、氢氧化钠、盐酸，均为国产分析纯。Neofuge 15R台式高速冷冻离心机：力康发展有 限公司；PHS-3C雷磁pH计：上海精科；ZXRD-7080全自动新型鼓风干燥箱：上海智城分析仪器制造有限公司；DK-8D数显恒温水浴锅：金坛市医疗仪器厂；RE52-98旋转蒸发仪：上海亚荣生化仪器厂；ScionSQ，456-GC气相色谱仪：美国布鲁克公司；Ultrospec5300 pro紫外可见分光光度计：上海市浦东张江高科技园区。
1.2试验方法
1.2.1沙漠果油的制备
分别采用5种不同的提取方法制备沙漠果油。
1.2.1.1索式法
料液比1：14( g/mL)、提取温度65℃、提取时间4h，简称样1。
1.2.1.2超声波法
功率200 W、频率45 kHz、料液比1：14(g／mL)、温度35℃、时间22 min，简称样2。
1.2.1.3水酶法
采用碱性蛋白酶酶解，在酶解pH为8、温度59℃、时间1.9 h、酶添加量为1 200 U/g，简称样3。
1.2.1.4水代法
兑水pH为6、料液比1：10( g/mL)、浸提温度70℃、时间2h，简称样4。
1.2.1.5热回流法
料液比1：10( g/mL)、提取温度45℃、提取时间4h，简称样5。
1.2.2沙漠果油中主要生物活性成分的测定
1.2.2.1脂肪酸的测定
脂肪酸的测定方法参见田洪磊[10] 稍做修改。
1.2.2.2 甾醇及VE等其他物质测定
甾醇及VE等其他物质测定方法参见田洪磊[10] 稍做修改。
1.2.3沙漠果油抗氧化性能研究
1.2.3.1 DPPH自由基清除能力[10]
配制0.1 mmol/L DPPH．的溶液，用无水乙醇将5种方法制备的沙漠果油样品及VE对照品配制成10，15，20，25，30和40 mg/mL待测。取2 mL DPPH．待清除液，加入2 mL不同质量浓度的待测油样，在室温黑暗条件下静置30 min后取出，在517 nm处测定吸光度At，并用2 mL蒸馏水代替油样作为空白对照Ao，用2 mL无水乙醇代替DPPH．溶液作为样品吸光度A’蒸馏水做参比对照，平行三次。则沙漠果油对DPPH．的清除率可表示为：
DPPH．的清除率=1-（At-A’）/A0×100% (1)
1.2.3.2 ABTS+自由基清除能力[11]
称取70.2 mg过硫酸钾溶于100 mL甲醇，用过硫酸钾甲醇溶液溶解ABTS+自由基，配成7.4 mmol/LABTS+．母液，在室温及黑暗条件下，静置过夜。
ABTS+．待测液：吸取1 mL ABTS+．母液用甲醇稀释5倍，在744 nm波长吸光度为0.700±0.020（吸光度为0.710），把全部母液按此比例稀释到所需的吸光度待测。
取2 mL ABTS+．测定液，加入2 mL不同浓度的油样，在黑暗处（室温）放置30 min取出，在744 nm波长处测定吸光度，以甲醇做参比。以VE为阳性对照。则沙漠果油对ABTS+清除率可表示为：
ABTS+．清除率=（A空白样品-（A样品-A对照））/A空白样品×100% (2)
式中：A空白样品-2 mL甲醇+2 mL ABTS+．的吸光度；A样品-2 mL油样+2 mL ABTS+．的吸光度；A对照 -2 mL油样+2 mL甲醇的吸光度。
1.2.3.3超氧阴离子自由基的清除能力[12]
用无水乙醇将不同方法沙漠果油配制成1，3，5，7，10和12 mg/mL的待测液，取0.1 mL不同质量浓度的沙漠果油于试管中，加入2.9 mL 0.05 mol/L pH 8.2的Tris-HCl，混合均匀后在25℃水浴20 min后，加入0.1 mL 3 mmol/L邻苯三酚溶液，混合均匀后25℃水浴5 min后，加入1 mL 8 mmol/L HC1终止反应。在299 nm波长处测定吸光度，以蒸馏水做参比。以VE做阳性对照。则沙漠果油对超氧阴离子自由基的清除率可表示为：
超氧阴离子自由基的清除率=（1-（A1-A2）/A3）×100% (3)
式中：A1-0.1 mL沙漠果油+2.9 mL Tris-HCl+0.1 mL邻苯三酚+1 mL HC1的吸光度；A2-0.1 mL沙漠果油+2.9 mL Tris-HCl+0.1 mL无水乙醇+1 mL HC1的吸光度；A3-0.1 mL蒸馏水+2.9 mL Tris-HCl+0.1 mL邻苯三酚+1 mL HC1的吸光度。
1.2.3.4羟基自由基清除能力[13]
用无水乙醇将不同方法沙漠果油配制成1，2，3，4，5，6 mg/mL的待测液，取1 mL质量不同浓度的沙漠果油于试管中，加入1 mL 0.75 mmol/L邻二氮菲和2 mL 0.2 mol/L pH 7.4的磷酸缓冲液，将混合物摇匀后加入1mL 0.75 mmol/L硫酸亚铁溶液，摇匀后加入0.1%的过氧化氢1 mL，摇晃均匀后再37 0C水浴1h，在536 nm波长处测定吸光度。则沙漠果油对羟基自由基的清除率可表示为：
羟基自由基的清除率=（A1-A3）／（A2-A3）×100% (4)
式中：A1-1mL邻二氮菲+2 mL PBS+1 mL油样+1mL FeSO4+1 mL H202的吸光度；A2-1 mL邻二氮菲+2mL PBS+1 mL油样+1 mL FeSO4+1 mL蒸馏水的吸光度；A3-1 mL邻二氮菲+2 mL PBS+1 mL蒸馏水+1 mLeS04+1 mL H202的吸光度。
1.2.4数据统计分析
采用SPSS 18.0计算IC50值，并对活性物质测定结果进行多重比较检验（p<0.05存在差异性），采用PCA分析法分析其相关性，所有数据进行3次平行。
2结果与讨论
2.1不同方法制备沙漠果油主要生物活性物质分析
由表1、表2 GC-MS测定沙漠果活性成分结果可知，几种方法制备的沙漠果油的生物活性成分多样且存在显著差异(p<0.05)，其中包含脂肪酸有14种，甾醇和其他生物活性物质10种。各个样品的单不饱和脂肪酸含量在36.95%—41.40%之间，多不饱和脂肪酸含量在29.01%—33.96%之间，较其他四种方法水酶法制备的样品不饱和脂肪酸含量最高。水酶法
制备的样品中油酸、亚油酸含量最高，十五烷酸、十七烷酸、亚麻酸、二十二烷酸、二十三烷酸、蓖麻油酸和木蜡酸未检出；超声波法制备的样品中油酸、亚油酸、棕榈酸含量较高，肉豆蔻酸、十五烷酸、十七烷酸、亚麻酸、二十二烷酸、二十三烷酸、蓖麻油酸和木蜡酸未检出；水代法制备的样品中油酸、花生酸、蓖麻油酸含量相对较高，十五烷酸、二十二烷酸二十三烷酸和木蜡酸未检出；回流法制备的样品中棕榈酸、棕榈油酸、肉豆蔻酸含量最高，花生酸、二十三烷酸和木蜡酸未检出；索式法制备的样品中棕榈酸、棕榈油酸、十七烷酸、硬脂酸、亚麻酸和蓖麻油酸含量相对较高。与脂肪酸相比，各个样品中甾醇和其他生物活性物质之间也存在较明显的差异，水酶法制备样品中豆甾醇△6. 22、胆甾-8，24--烯-3-醇、角鲨烯含量较高，水代法制备样品中胆甾-5-烯-3-醇、胆甾醇含量相对较高，回流法制备样品中胆甾-5-烯-3-醇、胆甾-8-烯-3-醇、胆甾醇、3-谷甾醇含量较高，索式法制备样品中角鲨烯和VE含量最高。
2.2沙漠果油抗氧化活性
2.2.1 DPPH自由基清除能力
由图1可以看出，5种方法制备的沙漠果油对DPPH自由基的清除效果随着沙漠果油浓度的增加而增大，呈很好的剂量关系，对DPPH自由基的清除效果较好。5种方法中水酶法提取的沙漠果油的清除效果最好，清除效果比VE弱。索式法、超声波法、水酶法、水代法、回流法及VE的IC50值分别为29.68，24.71，21.74, 26.37, 25.31和10.62 mg/mL，其对DPPH自由基的清除效果为：VE>水酶法>超声波法>回流法>水代法>索式法。
2.2.2 ABTS+自由基清除能力
从图2可知，5种方法制备的沙漠果油样品对ABTS+自由基有良好的清除效果，且随着沙漠果油质量浓度增大而增加，清除率与浓度呈正相关。浓度为16 mg/mL时水酶法提取的样品清除率达到73.59%，VE达到99.76%，清除效果较VE稍弱。索式法、超声波法、水酶法、水代法、回流法及VE的IC50值分别为15.20, 10.86, 8.47, 13.74, 11.89和1.53 mg/mL，其对ABTS+自由基的清除效果为：VE>水酶法>超声波法>回流法>水代法>索式法。
2.2.3超氧阴离子自由基的清除能力
由图3可知，在质量浓度1～12 mg/mL的测定范围内，5种不同方法制备的沙漠果油对超氧阴离子自由基清除能力随着质量浓度的增加而增加，清除率与质量浓度呈正相关，对超氧阴离子自由基的清除效果明显。5个样品清除效果均弱于VE，索式法、超声 波法、水酶法、水代法、回流法及VE的IC50值分别为 7.17, 8.15，7.28, 7.83，6.51和1.60 mg/mL，其对超氧阴离子自由基清除能力大小为：VE>回流法>索式法>水酶法>水代法>超声波法。
2.2.4羟基自由基清除能力
由图4可以看出，在测定质量浓度范围内，沙漠果油对羟基自由基有较强的清除能力，随着质量浓度的增加清除能力上升，清除效果与质量浓度有很好的相关性。当质量浓度为6 mg/mL时，水酶法对羟基自由基清除率达到92.88%，比VE同质量浓度的清除率(86.54%)高，有超过VE的趋势。索式法、超声波法、水酶法、水代法、回流法及VE的IC50值分别为3.10, 2.86，2.49, 3.43, 3.26和2.38 mg/mL，其对羟基自由基清除能力大小为：VE>水酶法>超声波法>索式法>回流法>水代法。
2.2.5不同样品抗氧化能力的IC50值
由表3可知，5种不同方法制备的沙漠果油样本抗氧化能力存在显著性差异，这可能与其生物活性物质的种类和含量的差异有关，对于具有复杂成分的天然物质的抗氧化体系中清除自由基可能是由多种抗氧化物质共同作用完成的。
2.3差值系数分析
为了更明确的不同方法制备沙漠果油样本中相关活性物质与抗氧化能力的关系，找出不同样本含量差异较大的成分尤为重要。差值系数可以直观的比较不同方法制备样品活性物质的之间的变化程度，以传统索式法制备的沙漠果油样本为参照，计算其他4个样品相关物质的差值系数[14]。
Y=（Ax-A0）/A0 (5)
式中：Y-差值系数；Ax-其他4种方法的活性物质含量；A0-索式法制备样品同一物质含量。
差值系数越大，代表差异越大，肉豆蔻酸（-0.67）、棕榈油酸（-0.71）、花生酸(0.62)、豆甾醇△6.22( 1.06)、胆甾醇(1.1 1)和B--谷甾醇(0.67)差值系数大，但有些物质含量基准较大，显示的差值系数会较小，如油酸(36.39%)、亚油酸(29.20%)、角鲨烯( 66.82%)等，差值系数与PCA结合分析，可以排除差异较小的物质。
2.4差异显著活性物质与抗氧化能力的PCA分析
在对不同沙漠果油样品抗氧化能力的研究基础上，为明晰沙漠果油多种生物活性物质体外抗氧化的作用方式，采用PCA分析5种沙漠果油样品中的24种主要活性物质和抗氧化指标的相关性。采用SPSS分析软件中PCA分析相关性结果图5所示。
由图5可知，第1成分贡献率为55.29%，第2成分贡献率为22.54%，2个成分的累计贡献率已达到77.83%，因此这2个主成分可以说明该数据的变化趋势，可以采用这2个成分做相关性分析。油酸、亚油酸、蓖麻油酸靠近DPPH自由基，其差值系数分别为0.13、0.16和-0.36，油酸(36.39%)和亚油酸(29.20%)基准含量高，所以差值系数小，油酸、亚油酸、蓖麻油酸可能与清除DPPH自由基相关；肉豆蔻酸、棕榈油酸、十五烷酸、十七烷酸和亚麻酸
靠近ABTS+自由基，其差值系数为-0.67、-0.71、0.00、- 0.10和-0.13，十五烷酸的基准(0.01%)、
十七烷酸(0.10%)和亚麻酸(0.11%)含量低，差值系数低，所以十五烷酸、十七烷酸、亚麻酸除外，肉豆蔻酸、棕榈油酸其协同作用对清除ABTS+自由基起关键作用；豆甾醇△6, 22、胆甾-8，24--烯-3-醇和麦角甾-8-烯-3-醇较接近超氧阴离子，可能是清除超氧阴离子的关键物质；角鲨烯、VE和豆甾醇△5，22接近羟基自由基，其差值系数分别为-0.11、-0.28和0.20,角鲨烯(66.82%)基准含量较高，所以差值系数小，豆甾醇△5，22( 1.14%)和VE( 0.39%)基准含量低，差
值系数也低，所以忽略豆甾醇△5，22和VE，角鲨烯可能与清除羟基自由基有紧密的相关性。
3结论
GC-MS共检测出24种具有明显差异性的活性物质，其中包括14种脂肪酸，10种甾醇和其它生物活性物质。沙漠果油有很好的抗氧化的能力，5种不同样本对不同的自由基清除效果也不同，通过比较IC50值，对DPPH自由基的清除效果为：VE>水酶法>超声波法>回流法>水代法>索式法，对ABTS+自由基的清除效果为：VE>水酶法>超声波法>回流法>水代法>索式法，对超氧阴离子自由基清除能力大小为：VE>回流法>索式法>水酶法>水代法>超声波法，对羟基自由基清除能力大小为：VE>水酶法>超声波法>索式法>回流法>水代法。通过PCA
分析沙漠果油生物活性物质和抗氧化指标之间的相关性，油酸、亚油酸、蓖麻油酸可能与清除DPPH自由基相关，肉豆蔻酸、棕榈油酸靠近ABTS+自由基且差值系数大，其协同作用对清除ABTS+自由基起关键作用，豆甾醇△6，22、胆甾-8，24--烯-3-醇和麦角甾-8-烯-3-醇较接近超氧阴离子，可能是清除超氧阴离子的关键物质，角鲨烯可能与清除羟基自由基有紧密的相关性。
沙漠果是良好的具有抗氧化作用的保健食用油，长时间食用可以预防和治疗老年退行性疾病。
4摘要
分别采用索式法、超声波法、水酶法、水代法、回流法制备新疆沙漠果油，使用GC-MS对不同提取方法制备的沙漠果油样本中脂肪酸和甾醇等生物活性物质的组成及含量进行分析鉴定，并以DPPH自由基、ABTS+自由基、超氧阴离子自由基和羟基自由基的清除能力为指标，分别对样本抗氧化能力进行测定。结果表明，沙漠果油有很好的抗氧化的能力，通过比较其IC50值，水酶法对自由基的清除作用较明显；同时将检测的生物活性物质和抗氧化能力进行PCA分析与差值系数分析，初步确定清除自由基的关键活性物质。
