作者：郑晓敏
高良姜（Alpinia officinarum Hance）为姜科( Zingiberaceae)植物高良姜的干燥根茎。高良姜是药食同源的一种植物，不仅在医药上有着很好的药理活性，而且在食品上被广泛的应用。国内外一些学者对高良姜中高良姜素槲皮素挥发油等提取工艺进行了研究，并将高良姜应用到了菠菜芒果等蔬菜、水果的防腐保鲜上，对活性成分、药效进行了研究。为了更好的对高良姜抑菌活性成分进行研究．提高其作为防腐剂的应用范围。试验对高良姜抑菌物质的提取进行了方法的筛选，并对影响因素及条件进行了优化，意在提高其经济价值。
1 材料与方法
1.1材料与仪器
高良姜（Alpinia officinarum Hance）：购于湛江徐闻。
无水乙醇、无水甲醇、丙酮、乙酸乙酯、石油醚（沸程60℃-90℃）均为国产分析纯；金黄色葡萄球菌（Staphylococcus aureus）、乙型副伤寒沙门氏菌( Beta paratyphoid Salmonella)、枯草芽孢杆菌（Bacillus subtilis）、蜡样芽孢杆菌（Bacilluscereus）、苏云金芽孢杆菌（Bacillus thuringiensis）、大肠杆菌（Escherichia coli）、副溶血性弧菌（Vibrioparahaemolyticus）、希瓦氏菌（Hawanella putrefacens），由广东海洋大学食品加工与安全重点微生物实验室提供。
GZX-9240 MBE型数显鼓风干燥箱：上海博讯实业有限公司；BL-620S型电子分析天平：日本Shimadzu公司；EYEL4 SB-IIOO型旋转蒸发仪：上海爱朗仪器有限公司；SiCMA 3-18K型高速冷冻离心机：德国进口；SW-CJ-2D型净化工作台：上海博讯实业有限公司；SPX-250B-Z型生化培养箱：上海博讯实业有限公司；LS-B50L立式压力蒸汽灭菌锅：上海华线医用核子仪器有限公司。
1.2试验方法
1.2.1材料预处理
高良姜根茎一清洗切片一烘干( 50℃)一粉碎（50目）-冰箱保存(4℃)
1.2.2提取液的制备
1)索氏抽提法：对黄慧珍的方法进行改进，得到浓缩液。于-20℃冰箱预冷，在超低温冰箱-80℃过夜，采用真空冷冻干燥机干燥，称重、计算得率，取冷冻干燥后的粉末制成0.1 g/mL的提取液。
2)超声波辅助提取法：称取粉末5 9，放人250 mL的锥形瓶中，石油醚提取3次，每次加入150 mL并于超声波清洗器中开机处理l h，把3次的提取液合并过滤，得滤液。
3)微波辅助提取法：称取粉末5 9，放入250 mL的锥形瓶中，石油醚提取3次，每次加入150 mL置于微波炉中处理30 s，把3次的提取液合并过滤，得滤液。
1.2.3菌悬液的制备
斜面接种供试菌种，培养温度为37℃，培养时间24 h。各挑取供试菌种一环，移人已经高温灭菌的LB肉汤中，培养16-18 h，进行系列10倍梯度稀释，血球计数板计数。使菌悬液的浓度达到108 CFU/mL。
1.2.4抑菌活性试验
采用双层平板法，生化培养箱37℃，培养18-24 h，每种菌平行试验3次，不加菌的试剂做空白对照。采用十字交叉法，用游标卡尺测量抑菌圈直径。
1.2.5单因素试验
分别将乙醇体积分数、提取次数、提取时间、料液比、浸提时间和提取功率进行单因素试验。
1.2.6响应面试验设计
在单因素的基础上进行了响应面设计，水平因素见表l。
2结果与分析
2.1不同方法的选择
在提取溶剂与浓度一定的条件下，采用3种方法对高良姜抑菌物质进行提取，抑菌试验结果如表2。可知，索氏抽提方法：枯草芽孢杆菌、大肠杆菌、副溶血性弧菌、沙门氏菌都不显著；超声波辅助提取，枯草芽孢杆菌、沙门氏菌、希瓦氏菌显著性不可以区分，大肠杆菌、副溶血性弧菌显著性不可以区分；微波辅助提取除了苏云金芽孢杆菌和副溶血性弧菌
不可以区分，剩下的菌显著性明显，另外对于金黄色葡萄球菌和蜡样芽孢杆菌两种指示菌来说，微波辅助提取的抑菌圈直径最大，分别为14.96±0.06 mm、19.28±0.17 mm。因此选择微波辅助提取方法作为提取高良姜抑菌物质的最佳方法。
2.2单因素试验
2.2.1 最佳乙醇体积分数的选择
从图1看出，高良姜提取物的抑菌能力随着乙醇体积分数的变化而变化，对于金黄色葡萄球菌，从乙醇体积分数30%-80%，抑菌能力是逐渐上升的，800-/0-1 000-10开始变化，800-/0时金黄色葡萄球菌抑菌圈直径达到最大值是17.28±0.32 mm，这可能与极性有关，由于一些醇溶性杂质、亲脂性、色素等成分的大量溶出，从而导致抑菌效果减弱‘14]。对于蜡样芽孢杆菌，在30%-500-/0是逐渐上升的，50%-700-/0略微下降，到90%达到最高值19.40±0.24 mm，而后下降。
2.2.2最佳提取次数的选择
从图2可知，提取次数与抑菌能力成负相关。一次浸提后有效成分己基本提取完毕，多次浸提会增加杂质量，影响有效成分的浸出。第一次提取率76.63%，第二次为14.23%，第三次为5.16%，综合提取率及抑菌活性可得出提取2次得率最高，抑菌活性一次为最佳。
2.2.3最佳提取时间的选择
从图3可知，抑菌物质的抑菌效果随着微波提取时间的延长，蜡样芽孢杆菌呈现出先上升后急剧下降的趋势，蜡样芽孢杆菌在20 s的时间时抑菌效果能力最强：17.16±0.32 mm；黄色葡萄球菌是先下降后急剧上升，再出现波动，黄色葡萄球菌在提取时间为30s时抑菌效果最好，是18.64±0.12 mm。原因可能是：随着时间的增加，溶液温度迅速升高，抑菌物质的溶解度得到了饱和，从而出现了抑菌活性先增大而后下降的趋势。有效成分长时间受热也可能导致生物活性的破坏，大量的杂质影响抑菌结果。
2.2.4最佳料液比的选择
从图4可知，提取物的抑菌能力随料液比的增加呈下降又上升再下滑的趋势。料液比在1：10-1：15( g/mL)时，抑菌圈直径急剧下降，蜡样芽孢杆菌16.26 mm下降到14.18 mm．黄色葡萄球菌由19.26 mm下降到17.18 mm;1：15-1：20 (g/mL)呈急速上升趋势，在1：20(g/mL)时两种抑菌圈直径得到最大：20.32 mm，17.44 mm，随料液比的增加，有效，分浸出加快，当料液比大于1：20( g/mL)之后，．菌圈直径急剧下降。选取1：20( g/mL)左右为最一料液比。
2.2.5最佳提取功率的选择
从图5可得，功率为300 W时，金黄色葡萄，菌、蜡样芽孢杆菌的抑菌活性都得到了最大值分别11.68，16.42 mm。功率过低，微波的穿透力较弱物料温度偏低，分子运动减慢，减弱了有效成分的出。功率过高，很可能导致有效成分结构的破坏，终选择功率为300 W。
2.2.6最佳浸提时间
从图6得出，0-2 h，抑菌圈直径下降，开始溶解不够充分，抑菌圈直径减小；在2-6 h内抑菌圈直径逐渐上升，蜡样芽孢杆菌4h时到达最大值20.62 mm，在6h时黄色葡萄球菌达到最大值18.24 mm，浸提时间超过6h后，随着时间的延长，急速下降。在浸提过程中浸出时间越长，则浸出物的浸出越充分、越完全，从表面上看似乎是有利的，但时间延长会使各方面消耗增加，有效成分长时间受热会导致生物活性的破坏，大量杂质成分溶出，结果并不乐观。
2.3响应面优化工艺
2.3.1 响应面试验结果
对影响较大的三个因素做了响应面分析，采用了JMP 7.0软件进行了设计。以黄色葡萄球菌为指示菌。在单因素基础上，采用了JMP软件中Box-Behnken模型，选取了提取时间（X）、乙醇体积分数（X）、浸提时间（X3）进行了三因素、三水平的响应面设计，最大抑菌圈直径为响应值(Y)，结果见表3。
2.3.2响应面模型分析
根据F值大小可以得到各变量对高良姜提取物 的影响顺序为：乙醇体积分数（X2）>浸提时间（X3）>提取时间（墨）。但都不显著。二项式X．2
( 0.007)，X22( 0.003)，X32( 0.004)的p值都得到了极显著水平(<0.01)，XIX2项、X2X3项、XIX3pfa均>0.05为不显著．说明提取时间、乙醇体积数、浸提时间不显著。从p值可以看出提取时间与醇体积分数、浸提时间的交互作用强于乙醇体积分，与浸提时间的交互作用。
2.3.3 响应面图分析
从响应面三维图可以直观的反应各因素对响应值的影响程度及交互作用的强弱。图7-图9知，一定范围内，当提取时间一定时抑菌能力随着乙醇体积分数的增大而增大，存在最大值，乙醇体积分数一定时，抑菌圈能力随着提取时间的延长而逐渐增大，存在最大值。即提取时间与乙醇体积分数交互作用图存在顶点，等高线为椭圆型，在提取时间为24-26。、乙醇体积分数在72%-780-/0范围内响应值较大；乙醇体积分数一定，随着浸提时间的延长，抑菌圈直径逐渐减小，趋势较为平滑；浸提时间一定，随着乙醇体积分数的增大，抑菌圈直径逐渐增大趋势较为陡峭，存在交点。与模型预测一致，乙醇体积分数与浸提时间的交互作用弱于乙醇体积分数与提取时间的交互作用；浸提时间一定时，随着提取时间的延长，抑菌能力是逐渐增大的，而后减小，说明随着提取时间的延长，有效成分的浸出可能是先增多后杂质增多，从而影响抑菌能力，存在极大值；提取时间一定时，随着浸提时间的延长，抑菌物质的能力是先减小后增大，可能与物料与溶剂的接触面积有关，从等高线上可以看出，图形为非椭圆，与模型中预测的交互作用不显著相一致。
2.3.4最佳工艺和验证试验
由jMP软件分析得到微波辅助提取高良姜抑菌物质的最佳工艺：微波功率300 W，提取时间25.23。，浸提时间4h，乙醇体积分数73.26qo，料液比1: 20( g/mL)，提取次数1次，在此条件下高良姜提取物对黄色葡萄球菌的抑菌圈直径为17.75 mm，转折条件提取时间24.85 s，乙醇体积分数75.77%，浸提时间3.94 h，此条件下抑菌圈直径是16.56 mm。由于试验条件的限制，适当调整为微波功率300 W，料液比1：15(g/mL)，乙醇体积分数75%，提取次数1次，浸提时间4h，此时的理论抑菌圈直径为16.56 mm，经过验证试验，实际的抑菌去圈直径为16.44±0.07 mm相对误差为0.7%。说明该模型可以应用于高良姜抑菌物质的提取，
3结论
国外已有利用微波辅助萃取薄荷精油、香柏油、芹菜脑、大蒜油等天然香料成分的专利。目前，国内利用此法已实现对佩兰、香叶天竺葵、木香植物挥发油成分的提取。微波辅助提取能有效的提取高良姜的抑菌物质，具有效率高、时间短、耗能少等优点。试验经分析得出的高良姜抑菌物质提取的最佳工艺：微波提取功率300 W，乙醇体积分数75%，料液比120(g/mL)，提取时间25 s，浸提时间4h，提取次数1次，此工艺条件可以为高良姜抑菌物质进一步研究和综合利用提供一定的参考及指导。
4摘 要
为找出高良姜抑菌活性物质提取的最佳方法，采用索氏抽提法、超声波辅助提取、微波辅助提取三种方法对高良姜抑茵活性物质进行提取，比较得出微波辅助提取其抑菌物质是最佳的方法。在单因素的基础上，筛选出影响较大的三个因素：提取时间、乙醇体积分数、浸提时间。并采用响应面法优化了提取工艺。通过JMP软件对数据进行分析，结果表明微波辅助提取高良姜抑菌物质的最佳工艺为：微波功率300 W，料液比1：20 (g/mL)，乙醇体积分数75%，提取时间25 s，浸提时间4h，提取次数1次。
