作者：曹健国
多糖是由糖苷键结合而成的糖链，是一类不溶于水、无甜味、不能形成结晶，无还原性和变旋现象的高分子碳水化合物，在临床上作用有很多，如调节免疫功能、抗癌、降血糖等。目前常用的多糖检测方法主要为将样品进行水提醇沉后，采用碱性酒石酸铜滴定法、比色法（苯酚一硫酸法、蒽酮一硫酸法）进行检测。若样品中存在淀粉，糊精类物质，因其在醇沉时也可以沉淀，会干扰样品多糖的检测结果，所以在做多糖分析时需要将其去除。常见的方法有AOACRoberts铜法、酶解法等。AOAC Roberts铜法主要通过碱性二价铜试剂选择性地沉淀具有葡聚糖结构的多糖而去除其他杂质的干扰作用，此法的缺点是需反复洗涤、多次过滤，操作步骤过多，使得测定结果误差较大。酶解法则是酶直接作用于淀粉、糊精，将其水解成葡萄糖，之后用乙醇沉淀分离粗多糖，进行检测。但在实际操作中需注意不同来源、不同厂家酶活力的差异，需进行试验以确定酶的用量。保健食品功效成分检测重点参考的《保健食品功效成分检测方法》中这两种方法可用于排除淀粉、糊精等对多糖检测的干扰，但未有二者效果对比的数据，且目前仍鲜见类似的文献报道。
灵芝是我国传统中药材，其中含有的活性多糖具有提高机体免疫力、抗肿瘤、抗氧化、抗衰老、清除自由基、降血糖等功效。灵芝咖啡为灵芝提取物与咖啡的合理配伍，对工作压力大、免疫力低下、易疲劳人士具有良好的保健作用。因该产品中除了含有上述活性多糖外，还含有部分淀粉、糊精类非活性多糖成分，在粗多糖检测分析时容易造成干扰。而《药典》2010版及其第二增补本“灵芝”项中关于灵芝多糖的检测也仅限于单味灵芝药材中多糖的检测，对其复方及含有淀粉等辅料的深加工产品中多糖的检测并未提及。因此试验分别对AOAC Roberts铜法、酶解法去除淀粉、糊精的干扰效果进行了对比，旨在筛选适用于灵芝咖啡中粗多糖定量分析的方法，并从中选出最佳方法进行工艺优化，为灵芝咖啡的质量控制及其他含有淀粉、糊精的产品中多糖的检测提供科学依据。
1 材料与方法
1.1材料与仪器
1.1.1材料与试剂
灵芝咖啡：福建仙芝楼生物科技有限公司；葡聚糖标准品：美国Sigma-Aldrich公司；液状a-淀粉酶：成都艾科达化学试剂有限公司；氢氧化钠、硫酸铜、磷酸氢二钠、磷酸二氢钠、柠檬酸钠、无水硫酸钠、蒽酮、硫酸、乙醇等试剂均为分析纯。
硫酸一蒽酮溶液：精密称取蒽酮0.1 g，加80%的硫酸溶液100 mL使溶解，摇匀。
0.2 mol/L磷酸盐缓冲液(pH 6.5)：31.5 mL( 0.2 mo/L)磷酸氢二钠与68.5 mL( 0.2 mol/L)磷酸二氢钠混合。
10%氢氧化钠溶液：称取100 g氢氧化钠，加水溶解至1L，加入固体无水硫酸钠至饱和，备用。
铜试剂储备液：称取3.0 g五水硫酸铜，30.0 g柠檬酸钠，加水溶解至1L，混匀备用。
铜试剂溶液：取铜试剂储备液50 mL，加蒸馏水50 mL，混匀后加入固体无水硫酸钠12.5 g，溶解，现用现配。
洗涤剂：取蒸馏水50 mL，加入50 mL铜试剂溶液，50 mL氢氧化钠溶液，混匀。
1.1.2仪器与设备
UV-2450紫外一可见分光光度计：日本岛津公司；KQ-100E型超声波清洗器：昆山市超声仪器有限公司；AR1140型万分之一电子分析天平：美国奥豪斯仪器有限公司；DK-S28电热恒温水浴锅：上海精科实业有限公司；Anke TDL-40B台式离心机：上海安亭科学仪器厂。
1.2方法
1.2.1标准曲线的绘制
精密吸取葡聚糖标准溶液（0.20 mg．mL-1）0，0.2，0.4，0.6，0.8和1.0 mL，分别置于25 mL比色管中，准确补水至2.0 mL，加入6.0 mL蒽酮硫酸溶液，在旋转混匀器上混匀，沸水浴中煮沸15 min，冷却后用分光光度计于625 nm处检测吸光度。以吸光度(Y)为纵坐标，葡聚糖质量(X)为横坐标，计算得回归方程。
1.2.2灵芝咖啡中粗多糖测定方法比较
1.2.2.1 常规水提醇沉法
精密称取灵芝咖啡样品2.0 g，置于100 mL容量瓶中，加入80 mL蒸馏水使其溶解，沸水浴中2h，定容，过滤，取5 mL加人无水乙醇20 mL，4℃冰箱中沉淀过夜，离心10 min，弃去上清液，沉淀用5 mL 80%乙醇溶液洗涤，离心后弃去上清液，沉淀定容至合适体积，吸取2 mL按1.2.1中方法进行显色并检测吸光度。
1.2.2.2酶解法
精密称取灵芝咖啡样品2.0 g，置于100 mL容量瓶中，加水80 mL，于沸水中加热15 min使其完全溶解，同时做空白对照（容量瓶中不加样品，其他操作同上）。将样品与空白样冷却至60℃以下，加入1.0 mLα-淀粉酶溶液和0.5 mL 0.2 mol/L磷酸盐缓冲液，60℃水中酶解60 min后取出（用碘液检验是否酶解完全，如不完全，延长时间至酶解完全），至沸水浴中灭酶30 min，冷却，定容，过滤。取5 mL滤液加入20 mL无水乙醇沉淀粗多糖(4℃，12 h)。离心后将沉淀用80%乙醇洗涤后离心弃去上清液，沉淀加水定容至合适体积，吸取2 mL置于25 mL比色管中，加入6.0 mL蒽酮硫酸溶液，参照1.2.1中方法进行显色并检测吸光度。
1.2.2.3 AOAC Roberts铜法
精密称取灵芝咖啡样品2.0 g，置于100 mL容量瓶中，加入80 mL蒸馏水使其溶解，100℃水浴中2h，定容，过滤，取5 mL加入无水乙醇20 mL沉淀粗多糖(4℃．12 h)，离心10 min，弃去上清液，沉淀用5 mL 80%乙醇溶液洗涤，离心后弃去上清液，加入5mL lo%氢氧化钠溶液，5 mL铜试剂，100 0C 10 min，冷却后离心，沉淀用洗涤剂洗涤2遍，加入1 mL lo%硫酸溶液，定容至25 mL，吸取2 mL按1.2.1中方法进行显色并检测吸光度。
1.2.3酶解法测定灵芝咖啡中粗多糖酶解条件优化
以粗多糖含量测得值为指标，根据单因素试验结果，选取酶解时间、加酶量、酶解温度为考察因素，采用L9(34)进行正交试验设计，对酶解条件进行优化。
1.2.4酶解法测定灵芝咖啡中粗多糖方法学试验
测定低限：平行测20次空白值并参照GB/T27404-2008中方法进行方法测定低限的计算。
精密度：精密称取6份2.0 g灵芝咖啡样品，采用酶解法进行粗多糖含量测定，考察方法的精密度。
稳定性：将精密度试验中醇沉后的粗多糖溶液样品分别在0，2，4，6，8和10 h时进行显色测定吸光度，考察溶液稳定性。
回收率：在已知粗多糖含量的灵芝咖啡粗多糖溶液中加入一定量的标准品，分别取测定低限浓度及2个合适浓度水平，每个水平测定3次，进行回收率试验。
2结果与分析
2.1灵芝咖啡中粗多糖测定方法比较结果
常规水提醇沉法、酶解法与AOAC Roberts铜法检测灵芝咖啡中粗多糖结果如表1。由表中常规水提醇沉法数据可知淀粉、糊精对样品中粗多糖含量测定结果影响较大。酶解法与AOAC Roberts铜法均可排除淀粉、糊精对样品中粗多糖含量测定的影响。但AOACRoberts铜法测得结果低于理论值，’且偏差较大，因该法需反复洗涤，多次离心，操作步骤过多，容易产生损耗，导致结果偏低。相比之下，酶解法测得值较接近理论值．因此采用酶解法进行灵芝咖啡中粗多糖的检测较合适。
2.2酶解法测定灵芝咖啡中粗多糖酶解条件优化
酶解法测定灵芝咖啡中粗多糖酶解条件正交试验结果见表2，方差分析见表3。
由表2和表3可知，各个因素对灵芝咖啡中粗多糖测定结果的影响顺序为酶解时间>酶解温度>加酶量。试验中灵芝咖啡粗多糖含量理论值为1.34%，因此最优条件应选择最接近理论值的A382C2组合，即酶解时间为60 min，加酶量为1.0 mL，酶解温度为75℃，且由表3中方差分析结果可知酶解时间、酶解温度对灵芝咖啡中粗多糖测定结果影响显著，加酶量影响不显著。
2.3酶解法测定灵芝咖啡中粗多糖方法学试验
2.3.1测定低限
方法的测定低限为0.001 21 mg/mL。
2.3.2精密度
灵芝咖啡中粗多糖含量平均值为1.38%，RSD=2.06%，精密度良好。
2.3.3稳定性
灵芝咖啡粗多糖溶液样品在10 h内稳定性良好，RSD=1.79%。
2.3.4回收率
回收率结果如表4所示。平均回收率为98.34%，RSD=2.48%。
3结论与讨论
α-淀粉酶，也称α-1，4葡萄糖-4-葡萄糖水解酶，可随机水解淀粉、糖原及降解物内部的α-D-1，4糖苷键，使底物溶液黏度下降和碘反应消失，产生可溶性糊精、低聚糖及少量麦芽糖、葡萄糖。目前较多地通过微生物发酵法制得，广泛应用于制糖业、酿造业、改性淀粉和纺织业高温退浆等工艺中。将淀粉酶用于富含淀粉的原料中活性多糖提取也是常采用的方法。试验将α-淀粉酶用于含淀粉、糊精等物质的产品中粗多糖的测定，取得了较理想的效果，与常规水提醇沉法及AOAC Roberts铜法相比，更接近产品中实际粗多糖的含量。正交试验得出最佳酶解条件为酶解时间为60 min、加酶量1.0 mL、酶解温度75℃，其中酶解时间、酶解温度对结果影响显著。酶解反应需要一定的反应时间及适宜的温度，当底物水解完全后，延长反应时间对结果无影响，温度过高过低均会影响酶活力，导致底物水解不完全，致使检测结果偏高。另外，酶的种类及保藏条件及时间也会影响酶的活力，因此反应条件的选择不能以一概全，需按具体情况进行考察。
在酶法降解淀粉过程中，文献报道较多采用淀粉酶与糖化酶（如α-葡萄糖苷酶）进行协同处理，试验发现将液态α-淀粉酶处理结束后的样液再加入α-葡萄糖苷酶（约为样液体积的1%）继续处理，测得粗多糖值与直接用液态α-淀粉酶处理所测得粗多糖值相比无显著差异，说明采用液态α-淀粉酶处理后的水解产物不会干扰灵芝咖啡中粗多糖的检测，因此，对文献报道中的方法做了简易化修改，即不采用a-葡萄糖苷酶进行处理。另外，在试验中发现，在酶解法进行检测时需加入空白对照，否则会使检测结果略偏高。
试验结果表明：酶解法可以较好地消除样品内淀粉、糊精等的影响，方法稳定、可靠，可作为灵芝咖啡中粗多糖的测定方法。
3摘要
建立灵芝咖啡中粗多糖含量检测方法并对其工艺参数进行优化。通过对常规水提醇沉法、AOAC Roberts铜法及酶解法几种方法进行比较，确定酶解法适合灵芝咖啡中粗多糖含量的检测。以灵芝咖啡中粗多糖含量为指标，通过正交试验设计考察酶解时间、加酶量、酶解温度等试验因素对检测结果的影响。采用该法进行检测的最佳条件为：酶解时间为60 min，加酶量为1mL，酶解温度为75℃。方法的精密度良好，其相对标准偏差为2.06%，且待测样品溶液在10 h内稳定，回收率为95.13%~103,33%，相对标准偏差为2.48%。采用酶解法可以较好地消除样品内淀粉、糊精等对粗多糖检测的干扰，方法稳定、可靠，可作为灵芝咖啡及其他含有淀粉、糊精的产品中粗多糖的检测方法。
