一种提高大鲵皮胶原蛋白肽提取率新方法

     作者：李斌      

    生产中制备胶原蛋白肽的方法有很多，目前使用最多、效果最好的是酶解法。但是由于大鲵皮表面粗糙，皮质较厚而且韧性较强，使其在加工过程中组织不易捣碎、酶解效率低等。采用高温高压处理大鲵皮不仅可以去掉部分死皮、色素等杂质，更重要的是可以软化组织，使鱼皮膨胀，提高后续制备胶原蛋白肽的效率。

    1  试验材料与方法

    1.1材料

    新鲜大鲵：饲龄3年，四川溪源水产养殖有限公司，人工去除肉和骨，用流动自来水彻底洗净，鱼皮切成5 cm3的块状，于-18 0C条件下贮藏；羟脯氨酸标准品：100 mg，sigma公司；氢氧化钠(AR)：成都科龙试剂厂；醋酸钠( AR)：成都科龙试剂厂；柠檬酸( AR)：成都科龙试剂厂；冰醋酸(AR)：成都科龙试剂厂；正丙醇( AR)：成都科龙试剂厂；氯胺T( AR)：成都科龙试剂厂；对二甲氨基苯甲醛( AR)：成都科龙试剂厂；70u/o过氯酸(AR)：成都科龙试剂厂。

    1.2试验仪器与设备

    紫外可见分光光度计：752N，上海精科实业有限公司；高温高压灭菌锅：上海洪纪仪器设备有限公司；马弗炉：SX2-12-10N，苏州江东精密仪器有限公司；微量凯氏定氮仪：KDN-04C，上海洪纪仪器设备有限公司；索氏抽提器：SXT-06，上海洪纪仪器

设备有限公司。

    2试验方法

    2.1大鲵皮常规分析

    水分的测定：105℃烘干恒重法“GB/T 5009.3-2010”；粗脂肪的测定：索氏抽提法“GB/T 5009.6-2003”；灰分的测定：箱式电阻炉550 0C灼烧法“GB/T 5009.4-2010”；粗蛋白的测定：微量凯氏定氮法“GB/T 5009.5-2010”。

    2.2大鲵皮中胶原蛋白含量的测定问

    羟脯氨酸是胶原蛋白肽的特征性氨基酸，不存在于一般的蛋白质及多肽中，故大鲵皮及其酶解液中胶原蛋白肽的含量可由其中所含羟脯氨酸的量乘以换算系数11.1得到。

    2.2.1标准曲线的制作

    羟脯氨酸标准曲线的绘制：取羟脯氨酸标准液10 mL，用蒸馏水稀释至100 mL，制得100 /mL的羟脯氨酸应用液。分别取O，2，4，6，8和10 mL定容至100 mL，制得标准液其质量浓度分别为0，2，4，6，8和10ug/ml。取标准液2 mL，依次加入8 mL正丙醇和2mL氯胺T试剂，室温下( 25℃)放置25 min。最后加入2mL恩里克试剂，混匀后置于65℃水浴锅（水浴显色)20min：冷却后读取560 nm下的吸光度。

    2.2.2大鲵皮中胶原蛋白含量的测定

    按照GB 9695.23-2008“肉和肉制品中L（一）一羟脯氨酸含量测定” 测定方法进行测定大鲵皮中羟请氨酸的含量．乘以系数11.1即得大鲵皮中所含胶原蛋白的量。

    2.3大鲵皮中胶原蛋白肽提取率的计算

    X=m/Mx 100%    (1)

    式中：X-胶原蛋白肽的提取率；m-胶原蛋白肽质量，g；M-大鲵皮胶原蛋白的质量，g。

    2.4大鲵皮胶原蛋白肽制备工艺

    大鲵皮制备预处理（去杂蛋白、去脂肪）高温高压处理酶解与灭活微滤超滤喷雾干燥成品

    2.4.1  大鲵皮预处理

    将人工养殖大鲵皮4℃冰箱过夜半解冻后，手动去除大鲵皮上残余的肌肉，剪成0.5 cm×0.5 cm的小片。于4℃下，先用0.1 mol/L NaOH溶液浸泡（液料比值为30 mUg）24 h，以去除非胶原蛋白，其间更换一次碱液；用去离子水洗涤至中性后，再用体积分数10 010正丁醇溶液浸泡（液料比值为30 mL/g）24 h以去除脂肪，其间更换一次溶液，最后用去离子水洗涤至中性。

    2.4.2大鲵皮高温高压处理工艺的优化

    对经过预处理的大鲵皮进行高温高压处理，以胶原蛋白肽提取率为指标，分别进行料液比、处理压力、处理时间的单因素试验，并根据单因素试验结果进行中心组合试验，采用SAS软件进行响应面分析，确定最佳的高温高压处理的工艺条件。

    2.4.3酶解与灭酶

    将经过高温高压处理的大鲵皮采用中性蛋白酶、木瓜蛋白酶和冯味蛋白酶三者组成的复合酶进行酶解处理，条件为：酶解温度为55℃，酶解时间7h，添加量中性蛋白酶3 000 U/g，木瓜蛋白酶8 000 U，风味蛋白酶600 U/g。酶解结束后灭酶，条件为：温度100℃，时间15 min。

    2.4.4微滤

    酶解液经过微孔滤膜过滤，得到含大分子的胶原蛋白肽滤液。

    2.4.5超滤

  将胶原蛋白肽液通过截流量分子量为5 000 Da的超滤膜，压力为0.4 MPa，最后得到大鲵皮胶原蛋白肽溶液。

    2.4.6喷雾干燥

  将大鲵皮胶原蛋白肽溶液进行减压浓缩后喷雾干燥(进风温度180℃，出风温度140℃，进料量600mL/h，得到大鲵皮胶原蛋白肽粉。

    3结果与讨论

    3.1大鲵皮的基成分

    取等质量头部、身体及尾部等不同部位的大鲵皮混合，进行分析检测。分别测定了水分、灰分粗、脂肪和粗蛋白，结果如表1。

    3.2大鲵皮的羟脯氨酸含量羟脯氨酸的标准曲线如图1。

    以羟脯氨酸质量浓度(ug/ml)为横坐标，吸光度（A560）为纵坐标绘制标准曲线，求出线性回归方程为：

    A=0.069 1X+O.O01 52    

    (2)式中：A-吸光度；X-羟脯氨酸质量浓度，ug.ml。 R2=0.996 81，这说明建立的回归方程是有意义的。检测表明人工饲养大鲵皮（湿重）的羟脯氨酸含量质量分数为2.01%，而鱼类胶原蛋白的平均换算系数为11.1，即胶原蛋白含量为22.31%，占总蛋白质的79.65%，故胶原蛋白是人工饲养大鲵皮中的主要蛋白质。

    3.3高温高压处理工艺的优化确定

    3.3.1单因素试验

    3.3.1.1料液比对胶原蛋白肽提取率工艺的影响

    将经过预处理的大鲵皮，在料液比为1：1．1：1.5,1：2,1：2.5和1：3( g/mL)，压力为0.1 MPa，处理时间为20 min的条件下进行单因素试验，结果如图2。

    从图2中可看出，料液比为1：1( g／mL)时胶原蛋白提取率较低，这是可能是因为较低的料液比条件下底物浓度较大，影响了酶与底物的接触面积。料液比为1：2( g/mL)时胶原蛋白肽提取率最高为83.6%，料液比为1：2.5和1：3(g/mL)时胶原蛋白肽提取率无明显差异(P>0.05)。所以后续的正交试验在料液比为1：1.5，1：2和1：2.5( g/mL)的区间内进行优化。

    3.3.1.2压力对胶原蛋白肽提取率的影响

    将经过预处理的大鲵皮反复清洗至废水为中性，在压力为0.025, 0.05，0.075，0.1和0.125 MPa，料液比为1：2( g/mL)，处理时间为20 min的条件下进行单因素试验，结果如图3。

    从图3中可看出，压力较低时，胶原蛋白肽提取率偏低，随压力的升高逐步增大，胶原蛋白肽提取率逐渐增大，最高达到84.8%．压力为0.1与0.125 MPa时皎原蛋白肽提取率无明显差异(p>0.05)。所以后续的中心组合试验在压力为0.05，0.075和0.1 MPa的区间内进行优化。

    3.3.1.3处理时间对熬胶工艺的影响

    将经过预处理的大鲵皮反复清洗至废水为中性，在处理时间压力为10，15，20，25和30 min，料液比为1：2( g/mL)，压力为0.1 MPa的条件下进行单因素试验，结果如图4。

    从图4中可看出，处理时间较短时，胶原蛋白肽提取率偏低，随处理时间的增加胶原蛋白肽提取率逐步增大，最高达到86.8%，时间为20与25 min时胶原蛋白肽提取率无明显差异(p>0.05)。所以后续的中心组合试验在处理时间为20，25和30 min的区间内进行优化。

    3.3.2高温高压处理大鲵皮工艺条件的优化

    对经过预处理的大鲵皮进行高温高压处理，以胶原蛋白肽提取率为指标，料液比(1：1.5，1：2和1：2.5(g/mL))、压力（0.05, 0.075和0.1 MPa）、处理时间（20，25和30 min）为试验因素进行三因素的中心组合试验设计，再采用SAS软件进行响应面分析，确定最佳的熬胶工艺，因素水平表如表2，结果如表3。

    3.3.2.1  回归模型方差分析及回归系数的显著性检验

    将所有因子和试验所得结果采用SAS软件进行回归拟合，所得的回归方程为：

    Y=80.466 67-0.137 5X1+1.875X2+0.837 5X3-1.758 333X12+0.525X1X 2-0.15X1X 3-0.233  33X22-0.525X2X3-10 808 333X32

    回归方程中各变量对响应值影响的显著性用F检验判定，p值越小，则响应变量的显著性程度越高，P< 0.01时，影响极显著；p<0.05时，影响显著，对上述回归模型进行方差分析和回归系数的显著性检验，结果如表4。

    由表4分析可得：回归模型的p=0.010  177< 0.05，表明模型显著，R2=0.946 5，拟合度>90%，表明回归模型能描述响应值的变化，因此可利用此模型对大鲵皮中胶原蛋白肽提取率的提取率进行分析和预测。回归模型的一次项X2压力）的p=0.001 095<0.01，表明压力对胶原蛋白肽提取率的影响极显著；X3料液比）的p=0.025 346<0.05，表明料液比对胶原蛋白肽提取率的影响显著；X1（时间）的p=0.654 922>0.05．表明时间对胶原蛋白肽提取率的影响不显著，三个因素对胶原蛋白肽提取率影响的大小顺序为X2>X3X1交互项对胶原蛋白提取率无显著影响；二次项X12、X32的P值均小于0.01，说明二者对胶原蛋白肽提取率影响显著。

    3.3.2.2响应面优化和预测

    利用SAS软件，通过多元回归方程作出对大鲵皮胶原蛋白肽提取率影响最显著的2个因素，即压力和处理时间的响应面和等值线图，结果图5。响应面的顶端为最优值。由回归方程解得试验最优工艺为：料液比1：2( g/mL)、时间25 min、压力0.075 MPa，每个试验平行2次。大鲵皮胶原蛋白肽提取率理论值预期可达80.76%。

    3.3.2.3验证试验

    在Box-RSM求得的最佳条件下，对大鲵皮胶原蛋白肽提取率进行5次平行提取试验，结果见表由表5。可知，实际测得率与理论得率相对误差为1.12%，RSD=0.3%，说明此工艺是科学的、合理的。

    4结论

    大鲵皮中羟脯氨酸的含量为2.01%（占湿重），而鱼类胶原蛋白的平均换算系数为11.1，即胶原蛋白含量为22.31%，占总蛋白质的79.65%，故胶原蛋白是大鲵皮中主要的蛋白质，具有很好的开发价值。

    采用高温高压处理经过预处理的大鲵皮，可以很好地软化的组织，提高胶原蛋白肽的提取率。通过对影响影响胶原蛋白肽的提取率的三个因素，即料液比、时间和压力进行单因素试验和中心组合试验以及响应面分析得出最佳高温高压处理工艺条件为：料液比为1：2( g/mL)、压力为0.075 MPa、处理时间为25min。

    5摘要 

    以胶原蛋白肽提取率为考察指标，对影响高温高压提高大鲵皮胶原蛋白肽提取率的三个主要因素，即料液比、处理时间和处理压力进行单因素试验，进而采用中心组合试验设计进行试验，用SAS软件进行响应面分析确定出最佳工艺条件，即料液比为1：2 (g/mL)、处理时间为25 min、处理压力为0.075 MPa，此时胶原蛋白肽的提取率高达80.76%。