苟雅玲， 王东， 杨苏才*， 宋云， 王海见， 李佳斌
（轻工业环境保护研究所，工业场地污染与修复北京市重点实验室，北京100089）
摘要：包气带是泄漏油品进入地下水的通道，存在多种类型的微生物。研究油品泄漏场地包气带土壤中微生物丰度及群落多样性特征，可为加油站场地土壤和地下水的微生物修复提供理论依据。该研究基于土壤DNA提取，16S r DNA实时定量PCR( polymerasechain reaction)和克隆文库的构建，分析了加油站土壤中微生物丰度及群落结构特征。实时定量PCR结果表明，表层土壤微生物丰度高于深层土壤约2个数量级，未污染深层土壤中微生物丰度高于污染的深层土壤约2个数量级。RDP( ribosomal database project)分析结果表明，加油站场地表层土壤微生物种类较丰富，而深层土壤微生物组成较单一，且污染的深层土壤细菌群落多样性明显低于对照场地深层土壤。研究也发现，与汽油降解相关的微生物菌群Beta-proteobacteria是深层污染土壤的主导微生物。
关键词：污染场地；土壤；微生物丰度；群落结构
中图分类号：X172doi:10.3969/j.issn．1003-6504.2016.06.001
文章编号：1003-6504,(2016)06-0001-06
我国目前已有加油站10余万座，仅北京市现有加油站就达1081座。由于埋地油罐和输油管线腐蚀或超龄使用已造成加油站油品泄漏问题日趋突出。截止2014年，美国已确认有近50万个埋地油罐存在泄漏，约为埋地油罐总量的1／4。壳牌公司在英国的加油站约有1/3已对当地土壤和地下水造成了污染，类似情形在捷克、匈牙利等国都有发生。国内尚未对加油站油品泄漏问题进行过系统调查，但发现部分建设时间较早的加油站已开始泄漏，并对地下水造成污染。如前些年北京市安家楼和六里屯加油站发生过严重漏油事故，曾一度迫使附近的自来水厂停止运行(http：//finance.ifeng.com/news/corp orate/20110828)。为此国务院常务会议于2011年讨论通过的《全国地下水污染防治规划（2011-2020年）》高度重视加油站场地污染修复工作。
包气带是指地面以下潜水面以上的地带，是大气水和地表水同地下水发生联系并进行水分交换的地带，是由矿物质和有机物质组成的固体物质、气体和水分占据的固体颗粒孔隙以及多种具有活性的微生物构成的复杂有机整体。当油品类污染物进入包气带后，土壤对污染物的吸附作用可使部分污染物滞留在土壤中。另外，微生物对有机污染物适应性的遗传机制表明，污染环境中的微生物之间可以发生水平基因转移或在微生物的染色体内进行基因重排、突变、复制，可以形成能够降解有机污染物的优势菌群。因此，长期受油品污染的土壤中可能存在能够降解油品的微生物，可部分降解进入包气带土壤中的油品。因此，研究油品泄漏场地包气带土壤中微生物丰度和群落多样性，有助于揭示包气带对油品类有机污染物的自然降解机制，可为加油站场地地下水保护提供理论依据。
本研究以某汽油泄漏的加油站场地为研究对象，通过实时定量PCR和克隆文库等现代分子生物学方法考察土壤微生物丰度和群落结构，为汽油污染土壤和地下水的微生物修复提供科学依据。
1材料与方法
1.1土壤样品的采集与保存
土壤样品于2013年3月采集自华北某加油站及附近区域。该加油站1992年开始运营，2011年发现该加油站存在泄漏现象，随后利用传统方法和快速调查评估方法对该场地进行了详细的污染调查评估，证实存在汽油泄漏，并确认了土壤的污染范围和程度。本研究中，在地下储油罐和加油机附近设置了2个采样剖面（A点和B点）。用水钻破开采样剖面上方的水泥层后，在A和B2个采样点分别采集了表层土壤(0~0.2 m)，编号记为AT和BT，深层土壤(5.8-6.0 m)，编号记为AS和BS。在加油站附近选取一无污染的土壤取样点CK，取样深度为表层(0～0.2 m，CKT)，深层(5.8～6.0 m，CKS)。用于挥发性有机污染物(volatile organic compounds，VOCs)测试的样品在现场用VOCs专用采样器将土壤样品加入到事先称重的含有10 m L甲醇的40 m L顶空瓶中，立即封盖，保存于带有冰袋的样品保存箱中，带回实验室立刻分析测试；用于提取土壤DNA的土壤保存于带有冰袋的样品保存箱中，带回实验室保存于-20℃，以便后续分析测试；其余的土壤保存于4℃以便分析土壤理化性质（表1）。
1.2土壤中特征污染物含量的测定
用于苯、甲苯、乙苯、苯乙烯、二甲苯、三甲苯、甲基叔丁基醚等VOCs以及TPH( total petroleum hydro-carbons)(C6-C9)分析测试的土壤样品的采集、保存和运输参照US.EPA 5035A方法，分析测定采用吹脱捕集／气相色谱-质谱法。
1.3微生物丰度分析
用MOBIO PowerSoil DNA Isolation Kit土壤DNA提取试剂盒提取土壤DNA，操作步骤按照试剂盒说明进行。以16S r DNA基因作为靶基因，利用实时荧光定量PCR对细菌基因群落的丰度进行检测。定量PCR反应在iC ycler IQ5 (Bio -Rad，USA)仪器上进行。探针和引物由北京诺赛生物工程公司完成，探针为5端以FAM（6-carboxy-fluorescien）标记作为荧光报告染料，3 端以TAMRA(6-carboxy-tetra-methylrhodamine)标记作为荧光淬灭染料。细菌的16S rDNA基因的扩增应用引物BACT11369F/PROK1492R和探针TM1389F，使用Premix remix Ex
TaqlM(TaKaRa)试剂盒(TaKaRa．Japan)。定量PCR产物用1.0%的琼脂糖凝胶电泳检测特异性。每个循环中荧光收集在83℃下进行，排除由于引物二聚体的存在所引起的误差。设置溶解曲线以检测扩增产物的特异性，其反应程序在55～99℃之间，每0.5℃读数，其间停留10 s。起始模板浓度由Ct值确定。数据分析采用仪器自带软件iCycler(version l.0.1384.0 CR)进行分析。
1.4克隆文库的构建和序列分析
以土壤样品提取所得的DNA为模板，对所得16S rDNA基因片段采用TaKaRa Agarose Gel DNAPurification Kit Ver.2.0( TaKaRa)切胶纯化，具体操作按照产品说明书进行，最后用50 VL灭菌水洗提。将纯化后的DNA片段通过pGEM-T Easy Vector SystemI( Promega)试剂盒连接在载体上，转化感受态大肠杆菌细胞( JM109)( TaKaRa)，涂布到含有氨苄青霉素( Ampicillin )/IPTGIX-Gal的LB( Luria-Bertani)培养基上，37℃下培养16～24 h。随机选取一定数量的白色克隆子，采用菌体直接扩增方式，用pGEM-TEasy Vector通用引物T7/SP6扩增外源插入片段，用T7/SP6进行扩增反应，反应条件如下：94℃下5 min，随后35个循环包括94℃下30 s，50℃下30 s，72℃下45 s，最后是72℃下延伸5 min。通过电泳的方法检验含有插入片段的克隆子。在RDP( RibosomalDatabase Project)数据库(http://rdp.cme.msu.edu/
index.jsp)中对16S rDNA序列进行分类，使用treeBuilder软件构建了系统发育树。
2结果与讨论
2.1 土壤污染特征
AT和BT 2组表层土壤汽油特征污染物的含量低于方法检测限（表2），但深层检测出汽油特征污染物，浓度为45.64～73.68 mg/kg。并且B点污染物浓度高于A点。对照场地中CKT、CKS加油站特征污染物含量低于检测限。由于该加油站地下储油罐位于地下3m处，故汽油污染物的泄漏主要发生在地下3m左右。前期工作表明，该汽油污染场地3～5 m以下的土壤以砂土和粉土为主，非常利于汽油在重力的作用下向下迁移扩散；同时，较低的土壤有机碳含量导致吸附在土壤颗粒和孔隙中的污染物量有限。所以，该场地AS和BS 2组深层土壤检出汽油特征污染物。表层AT和BT 2组土壤样品未检出特征污染物，是由于汽油垂直向上的迁移扩散被上层存在的黏土层阻隔，污染物未能迁移至表层土壤中。
2.2土壤细菌丰度
土壤样品AT、AS、BT、BS、CKT、CKS的细菌定量分析结果（图1）表明，加油站场地内表层土壤AT和BT的细菌log拷贝数分别为(6.96+0.09)和(7.48+0.03)，深层土壤AS和BS的细菌log拷贝数分别为( 4.98+0.31)和(5.29+0.30)。表层土壤的细菌丰度远远高于深层土壤AS和BS的细菌丰度（约2个数量级）。对照场地土壤CKT的细菌丰度为(9.02+0.05)（log拷贝数），也高于深层土壤CKS的细菌丰度(log拷贝数为(7.42+0.02))。此外，加油站表层土壤的细菌丰度与对照场地深层土壤的细菌丰度相当。总的来说，表层土壤的细菌丰度高于深层土壤，具有水泥覆盖层的表层土壤的细菌含量远低于无水泥层覆盖层的对照场地表层土壤，未污染的深层土壤中细菌丰度高于污染的深层土壤。
Fierer等对加利福尼亚州的一处冻融土壤剖面进行微生物量分析，结果显示深层土壤(2m)的微生物密度比表层土壤(25cm)低1～2个数量级。许多学者也在其他土壤剖面中观察到相似的微生物丰度模式，认为微生物数量随着剖面深度的增加而降低。表层土壤微生物含量高于深层土壤，可能是表层土壤总有机碳量高于深层，并且C/N也高于深层土壤，而可利用碳影响微生物群落数量的垂直分布。本研究中，表层土壤样品的有机碳含量均不同程度地高于深层土壤有机碳含量，微生物含量也高于深层，说明土壤中有机碳量和微生物量有紧密的联系。污染场地土壤细菌含量低于对照土壤，可能是由于污染物进入土壤后，改变了土壤的生物毒性，抑制了某些微生物的生长。
2.3微生物群落多样性
土壤微生物群落多样性，是指土壤微生物群落的种类和种间差异，微生物群落多样性包括物种多样性、遗传多样性及生理功能多样性等。微生物群落多样性的研究可以通过分析土壤中细菌种类、丰度分布均匀性，了解土壤污染前后微生物多样性变化。本研究选取CKT、CKS、AT、AS、BT、BS的土壤样品建立克隆文库，CKT、CKS、AT、AS、BT、BS测序97～99
个克隆。基于克隆文库的RDP分析结果见图2。CKT测得的序列可归人13个细菌类群（门），Beta-proteobacteria是主要的类群(29%)，其次是Acidoba-cteria (27%)、Gamma-proteobacteria( 9%)、Sphingoba-cteria( 7%)、Actinobacteria( 4%)等。CKS测得的序列可归入7个细菌类群（门），Beta-proteobacteria是主要的细菌类群(65%)，其次是Gamma -proteobacteria(24%)、Alpha-proteobacteria( 7%)等。AT测得的序列可归入12个细菌类群（门），Beta-proteobacteria是主要的细菌类群(24%)，其次是Bacilli( 12%)、Actino -bacteria(8%)、Alpha-proteobacteria( 8%)、Gamma-pro-teobacteria( 7%)等。AS测得的序列可归入2个细菌类群（门），Beta-proteobacteria是主要的细菌类群，其相对丰度约占98%。BT测得的序列可归人12个细菌类群（门），Actinobacteria是主要的细菌类群(45%)，其后依次为Alpha-proteobacteria( 15%)、Beta -proteo -bacteria( 11%)、Bacilli( 10%)等。BS测得的序列主要是Beta-proteobacteria，其相对丰度为99%。
到目前为止，研究人员在等还原条件下已分离出多种能高效降解苯系物（苯、甲苯、乙苯、二甲苯）和烷烃的微生物菌群（表3）。这些微生物大多属于Beta-proteobacteria。本
研究中，加油站场地表层土壤微生物种类较丰富，而深层土壤微生物组成较单一，主要为Beta-proteo -bacteria，此外，受汽油污染的深层土壤中Beta-proteo-bacteria占绝大多数，而未受污染的对照场地除Beta-proteobacteria外还有'Gamma-proteobacteria和Alpha-proteobacteria，可能是由于在污染物的胁迫下，部分对汽油污染物敏感的微生物种群无法适应环境，其数量逐渐减少。Sutton等和宋佳宇等对柴油和汽油污染场地微生物群落的研究也分别发现相似现象。微生物在汽油污染的环境中发生基因重排、突变和复制后，可能形成能够降解有机污染物的优势菌群，有利于污染物的微生物降解。
3结论
本研究选取加油站AT、AS、BS、BT和对照场地CKT、CKS的土壤提取DNA，应用实时荧光定量PCR和基于克隆文库的RDP测试分别分析了土壤中微生物丰度与群落多样性。分析结果表明：(1)表层土壤的细菌丰度高于深层土壤，具有水泥覆盖层的表层土壤的含量远低于无水泥层覆盖的对照场地表层土壤。(2)未受汽油污染的深层土壤中细菌丰度高于受污染的深层土壤。(3)污染土壤细菌群落多样性明显低于对照场地土壤，与汽油降解相关的微生物菌群是Beta-proteobacteria，在汽油污染环境中大量繁殖、富集，逐渐成为场地中的优势菌群。
