高效液相色谱-原子荧光测定婴幼儿辅食中汞的形态

 戴彦韵，胡子峰，鲍笑岭，裴炜

 上海市质量监督检验技术研究院／国家食品质量监督检验中心（上海200233）

摘要建立了以盐酸+L -半胱氨酸为提取液，采用高效液相色谱-原子荧光联用技术测定婴幼儿辅食中的汞的形态的分析方法。在优化条件T,3种汞化合物的线性范围为0~50μg／L，相关系数(r)均优于0.999 0，检出限在3.70-7.71μg/kg之间，3种汞化合物加标回收率均在89.6%~107%之间，重现性RSD=3.5%，标准物质鱼肉(GBW 10029)的测定值在标准值范围内。选择市场上常见种类的婴幼儿辅食进行检测，甲基汞含量在11.3～12.5μg/kg之间。

关键词婴幼儿辅食；汞；甲基汞；形态分析；高效液相色谱；原子荧光

 汞是一种毒性较大、熔点低、易挥发的重金属，在自然界中以单质汞、无机汞和有机汞的形态存在。汞的毒性与其存在形态密切相关，有机汞毒性大于无机汞，其中又以甲基汞毒性为最强。甲基汞是脂溶性分子，易于穿透生物膜，在人体胃肠道中的吸收高达95%。甲基汞极易通过血脑屏障和胎盘屏障，在胎儿的脑部和其他组织蓄积，阻滞胎儿脑部发育。

 我国食品中污染物限量标准( GB 2762-2012)规定食肉鱼类和非食肉鱼类的甲基汞限量分别为1.0mg/kg和0.5 mg/kg，规定婴幼儿罐装辅助食品总汞限量值为0.02 mg/kg，而对汞的形态没有要求。2013年4月，媒体报出多家知名品牌以深海鱼类为原料的婴幼儿罐装辅助食品样品有总汞含量超标情况，引起社会对甲基汞危害的强烈关注。由于婴幼儿辅食限量值仅为0.02 mg/kg，而婴幼儿辅食中广泛添加深海旗鱼和金枪鱼等肉食性鱼类，这就需要一种更加简单快捷、检出限低和重复性好的检测方法。

 目前，国内外对甲基汞的测定方法主要集中在HPLC-AFS和HPLC-ICP-MS两种方法上。HPLC-ICP-MS法灵敏度较高，但由于仪器昂贵和运转费用高，对操作技术要求也较高，因而较难在我国常规实验室中得到普及应用。而AFS对汞元素检测的灵敏度可-1CP-MS相当，同时是我国具有自主知识产权的技术，仪器价格低、操作简便易于掌握，更适合我国国情。近年来HPLC-AFS已较多地应用于环境及食品样品中的汞元素形态分析，并多次见报成功通过甲基汞检测国际比对，已成为汞形态分析中可靠的检测方法之一。试验建立了以盐酸+L-半胱氨酸为提取液，采用高效液相色谱-原子荧光联用仪测定婴幼儿辅食中的汞的形态的方法，满足了婴幼儿辅食检测工作量大、检出限低的要求，具有很强的实用性。

1试验部分

1.1试剂和标准溶液

 汞单元素溶液标准物质、甲醇中甲基汞溶液标准物质、甲醇中乙基汞溶液标准物质、鱼肉中总汞与甲基汞标准物质( GBW 10029)：中国计量科学研究院；乙腈（色谱纯）、L-半胱氨酸：SIGMA;乙酸铵( GR)：沃凯；氢氧化钾、氨水、盐酸、硼氢化钾、过硫酸钾：分析纯，国药集团。

1.2仪器装置和分析条件

 液相色谱：Agilent 1200液相色谱仪（美国安捷伦），Venusil MP-C18色谱柱(150 mm×4.6 mm，5μm，美国Agela)，流动相为体积分数5.0%的乙腈-0.05 mol/L乙酸铵-1 g/L L-半胱胺酸，流速1 m L/mm，进样量80μL。

 原子荧光：AFS 9800（配备高强度在线紫外消解，北京海光），点火，负高压300 V，汞灯电流30m A；载液为体积分数5%的HCI，泵速50 r/min；还原剂0.5 g/L硼氢化钾-0.1 g/L氢氧化钾溶液，泵速50 r／min；载气400 m L /min，屏蔽气600 m L /min。

 DMA-80自动测汞仪（意大利Milestone公司），进样量0.1 g。

1.3汞形态分析前处理方法

 将样品粉碎均匀后，称取约1 g于15 m L离心管中，加入7 m L 1%体积分数的HCl-1 g/L L-半胱氨酸提取液，涡旋振荡，常温下超声提取0.5 h。待样品冷却后以上述提取液定容至10 m L，于4℃下以8 000 r/min转速离心5 min，取上清液过0.45μm水相滤膜，上机。

1.4总汞测定方法

 总汞的测定由DMA-80自动测汞仪完成，进样量为0.1 g。

2结果和分析

2.1样品前处理方法

  试验样品前处理方法参照实验室朱晨华等的先期研究，未做进一步优化处理。

2.2液相色谱分离条件

 为实现不同形态的汞的分离，需要在标准溶液、样品提取液和流动相中添加络合剂。常用的络合剂有2-巯基乙醇和L-半胱氨酸，试验选择毒性较低、较容易获得的L-半胱氨酸。尚晓虹等的研究表明，L-半胱氨酸在0.1～5 g/L范围内甲基汞、无机汞及乙基汞的保留时间和灵敏度均没有明显变化，试验也证实了这一结论。试验中发现L-半胱氨酸容易失效，表现为3种形态的汞同时出峰，在色谱柱上均无保留，所以提取液和流动相最好当天配制。这可能由于L-半胱氨酸容易跟空气中的氧气反应而失去络合作用。

 根据吕超等的研究表明，当提取液pH为2～3时，对3种形态的汞分离较好，而试验中发现流动相pH对3种形态的汞出峰时间和峰形均无明显影响。又因Venusil MP C18柱属中等极性柱，适用pH 1.5～8.5，pH范围较宽，所以流动相无需调节pH，提取液也无需中和后再上机。

 Agilent 1200液相色谱仪配备四元泵和在线脱气机，可实现任意比例的四元低压混合。配制A道为0.05 mo/L乙酸铵-1 g/L L-半胱胺酸溶液，辅以任意比例的有机相（如C道甲醇，D道乙腈），可轻松实现流动相有机溶剂组成和配比的优化。经试验得知，以乙腈为有机溶剂时，汞各种形态的峰形均优于以甲醇为有机溶剂，而当乙腈达到5%时Hg2+、甲基汞和乙基汞可实现基线分离，峰形对称尖锐，如图1。

2.3原子荧光检测条件

 试验以硼氢化钾-氢氧化钾溶液为还原剂，并对还原剂浓度进行了优化。优化结果表明，较高浓度的还原剂生成较多氢气，容易将汞蒸汽稀释，造成信号降低，最终选择0.5 g/L硼氢化钾-0.1 g/L氢氧化钾溶液。

 汞化合物经紫外消解和蒸汽发生后，进入气液分离器，并由载气携带进入检测器中检测，而载气流速会影响信号的强弱。在200～800 m L/min范围内调节载气流速，发现载气流速的变化对保留时间基本没有影响。但流速太低，汞蒸汽不能被及时吹入检测器，会导致色谱峰较宽；流速太高，汞蒸汽又会被稀释，导致信号降低。试验选择400 m L/min的载气流速。在载气流速选定400 m L/min时，在400～900 m L/min范围内调节屏蔽气流速，发现载气流量过低时基线波动较大，过高时信号降低，试验选择600 m L/min的屏蔽气流速。

  蒸汽发生原子荧光法检测有机汞时必须先将有机汞转变成无机汞，否则会因有机汞氢化物发生效率很低而导致难以检测。有机汞转化成无机汞常用的方法有紫外光照射或氧化反应。试验所用AFS 9800仪器配备高强度的紫外在线消解系统，有6根高强度紫外灯管，消解管长度超过5m，管径极细，不会产生较大出峰延迟；系统还配制2个高速风扇，可消除紫外灯长时间照射造成的升温现象，提高了仪器测量的重现性。

2.4方法学考察

2.4.1线性范围和检出限

 以流动相配制3种汞化合物的混合标准溶液，质量浓度分别为0，1，2，5，10, 20和50μg/L，进行线性范围试验，以峰高作定量依据，线性相关系数(r)优于0.999 0；以3倍基线噪声测定3种汞形态的检出限（S/N=3），结果见表1。

2.4.2重现性

 由于找不到3种汞形态都存在的样品，选择某品牌海陆肉松（非婴幼儿辅食，含猪肉、金枪鱼肉等）为对象，平行测定6次，样品谱图见图2，甲基汞测定结果见表2。

2.4.3加标回收率

 在3种汞检测均呈阴性的三文鱼番茄泥样品加标，加标回收结果见表3。

2.4.4标准物质测定

 标准物质GBW 10029鱼肉中甲基汞证书标定值为0.84±0.03 mg/kg，实际测定值为0.86 mg/kg。

2.5实际样品测定

  采用试验所建立的方法，对市售各类婴幼儿辅助食品各种汞形态和总汞进行测定，结果见表4。

3结论

  试验建立了以盐酸+L-半胱氨酸为提取液，采用高效液相色谱-原子荧光联用仪测定婴幼儿辅食中的汞的形态的方法，满足了婴幼儿辅食检测工作量大、检出限低的要求，具有很强的实用性。所检测12种婴幼儿辅食总汞均在0.02 mg/kg以下，符合GB 2762-2012相关规定。四种总汞阳性样品均含深海旗鱼或金枪鱼等肉食性鱼类，总汞中，甲基汞占90.8%～95.8%，从另一方面佐证了总汞的来源是肉食性鱼类的添加。

 尽管试验收集的样品均符合相关规定，但从海陆肉松样品甲基汞含量较高（104μg/kg）来看，婴幼儿辅食中肉食性鱼类添加比例较高时还是有可能引起总汞超标，提醒人们添加肉食性鱼类的婴幼儿辅食应是食品安全监管的一个长期的重点。