不同组成的果聚糖对两歧双歧杆菌体外生长的影响

 周皓东，周艳，刘丽萍，夏刚强，韦策，张红漫*

 南京工业大学化学与分子工程学院（南京211800）

摘要选用5种商品化果聚糖替换合成培养基中的葡萄糖，对两歧双歧杆菌进行体外培养，通过测量发酵液中OD值及pH的变化，考察了5种商品化果聚糖对两歧双歧杆菌体外生长的影响。结果表明，低聚果糖与菊粉对两歧双歧杆菌均有显著的促生长作用，且组成不同的果聚糖对两歧双歧杆菌的体外生长有着不同的影响。其中，保龄宝与青海威德公司生产的低聚果糖，其对两歧双歧杆菌的促生长作用分别为葡萄糖的2.71倍及1.96倍：青海威德与比利时Orafti公司菊粉的促生长作用分别为葡萄糖的2.78倍及1.64倍：而Orafti公司的多聚果糖对这一菌株未呈现出明显的促生长作用。

关键词  低聚果糖；菊粉；多聚果糖；两歧双歧杆菌：体外生长

 人体内肠道菌群的均衡对于维持人体健康有着非常重要的作用，如何促进肠道内有益菌群如双歧杆菌、乳酸菌等的生长已经成为国内外研究的热点。以果聚糖等为代表的益生元，进人人体后可逃逸消化道的消化，以原形在结肠内被双歧杆菌等益生菌发酵利用，从而选择性地促进其生长，因而具有抵御病原微生物侵袭，降低肠道pH，促进微量元素吸收及骨骼生长，以及预防结肠癌等功效。由于果聚糖所含聚糖的聚合度不同，一般分为低聚果糖、菊粉及多聚果糖。低聚果糖，又称为果寡糖，聚合度在2～9之间。其来源主要有两种：一是以蔗糖为原料，通过酶法进行分子内果糖苷转移反应生成的蔗果型低聚果糖；二是以菊芋、菊苣为原料提取的菊粉，经酶解或酸解后形成的果型为主的低聚果糖。菊粉是一种由D-呋

喃果糖分子以β (2→1)糖苷键连接而成的果聚糖混合物，聚合度通常在2～60之间，由菊芋、菊苣等原料经热水提取而成。国外主要以菊苣为原料生产菊粉，而国内多以菊芋为原料生产。多聚果糖的结构与菊粉相似，但聚合度通常在30以上，可从菊粉中分离制得。

 由于目前对组成不同的商品化果聚糖的益生元效果研究不多，同时现有研究中多采用天然培养基来培养，由于天然培养基的组分较复杂，往往反映不出果聚糖的真实效果；而合成培养基由于碳源组成单一明确，进行果聚糖碳源替代后效果明显。鉴于此，选取了5种商品果聚糖替换合成培养基中的葡萄糖碳源，并以葡萄糖碳源作为对照，比较了5种商品果聚糖对两歧双歧杆菌体外生长的影响，旨在为相关领域的研究提供基础数据。

1  材料与方法

1.1试验材料

 两歧双歧杆菌AB 20402:中国典型培养物菌种保藏中心；低聚果糖：保龄宝生物股份有限公司、青海威德生物技术有限公司；菊粉：比利时Orafti公司、青海威德生物技术有限公司；多聚果糖：比利时Orafti公司。5种样品分别记为低聚果糖（保）、低聚果糖（威）、菊粉( Or)、菊粉（威）及多聚果糖(Or)。

1.2仪器与设备

 YX280A*手提式不锈钢压力蒸汽灭菌器：上海三申医疗器械有限公司；VD-850型桌上式洁净工作台：苏州净化设备有限公司；THZ-D台式恒温振荡器：太仓市强乐实验设备有限公司；DHP 9032电热恒温培养箱：上海一恒科学仪器有限公司；PHS-25型数显酸度计：杭州齐威仪器有限公司；UV1800紫外可见分光光度计：上海美谱达仪器有限公司。

1.3试验方法

1.3.1样品分析

 样品中水分含量按照国标GB/T 23528方法测定；方法，首先用DNS法测定样品中的还原糖含量，然后用苯酚硫酸法测定其总糖含量，利用总糖与还原糖含量之差计算样品中的聚糖含量。

 高效液相分析条件（Waters 2695色谱仪）：Waters Xbridge Amid色谱柱；流动相采用梯度洗脱模式，30 min内乙腈与水的配比从75：25变为50：50，之后保持不变；流速1 m L/min。

1.3.2培养基

1.3.2.1  活化培养基

 活化培养基由中国典型培养物菌种保藏中心提供。

1.3.2.2基础培养基

 葡萄糖1g，氯化钠5g，硫酸镁(MgSO4.7H2O)0.2 g，磷酸二氢铵1g，磷酸氢二钾1 g，蒸馏水1 L，pH 6.5，

1.3.2.3试验培养基

 将基础培养基中的葡萄糖用5种果聚糖样品按同等比例替换。

1.3.3菌种活化

 两歧双歧杆菌冻干粉经无菌水溶解后，接种到20mL活化培养基中，37℃静置培养24 h。吸取200μ L菌悬液于20 m L活化培养基中，37 ℃静置培养24 h。经两次活化后，制成菌悬液。

1.3.4果聚糖对两歧双歧杆菌体外生长的影响

  将菌悬液按1%的接种量分别接种于基础培养基与试验培养基中，通氩气除氧后，37℃摇床培养，考察48 h内菌株的生长情况。以培养基的OD600nm绘制生长曲线，测量培养基中的pH绘制酸度变化曲线，对比稳定期基础培养基与试验培养基的OD600nm。

2结果与讨论

2.1样品分析

  参照GB/T 23528（低聚果糖国家标准）规定，样品含水量应为5% 以下，从表1可见，5种样品的含水量均达标。同时，根据还原糖和总糖的测定结果计算，5种样品的聚糖含量均在89%以上，可满足试验要求作为培养两歧双歧杆菌的碳源。

 图1的高效液相图谱揭示了5种商品果聚糖在组成上的差异。保龄宝公司的低聚果糖组成比较简单，两个主组分分别在16和19 min的位置出峰。比较而言，青海威德公司的低聚果糖组分相对较多，在7～25 min的出峰时间可见多个组分。其原因可能是保龄宝的低聚果糖以蔗糖为原料，经酶法反应生成的蔗果型果聚糖组成比较单一。威德的低聚果糖是以菊芋为原料提取的菊粉经酶解后制得的，因而组成相对比较复杂。从Orafti公司与青海威德公司生产的菊粉组成来看，两种产品的组成均较低聚果糖更为复杂，Orafti菊粉的组分出峰时间主要集中在6～40 min，威德菊粉的组分出峰时间主要集中在10～33 min。其组成的差异主要是因为Orafti菊粉以菊苣为原料生产，而威德菊粉以菊芋为原料提取而得。图1中也可以看到，多聚果糖由于聚合度比较高，分离比较困难，出峰时间主要集中在30～40 min，且其峰型较差。

2.2果聚糖对两歧双歧杆菌体外生长的影响

 图2为两歧双歧杆菌在葡萄糖及5种商品果聚糖为碳源下的生长曲线。可以看出，0～12 h为菌体生长的适应期，在此期间菌体生长缓慢，不同碳源未表现出明显区别。12～40 h，菌体进入对数生长期，此阶段菌体生长迅速，且在不同碳源体系呈现出了显著的差异。图2中可见，与葡萄糖碳源相比，保龄宝的低聚果糖与青海威德的菊粉对两歧双歧杆菌的促生长作用最为明显，其生长速率明显高于其他各组；其次为青海威德的低聚果糖与Orafti的菊粉，两歧双歧杆菌在此两种碳源中的生长速率均明显高于葡萄糖碳源中的生长速率；多聚果糖碳源未表现出对两歧双歧杆菌的促生长作用，其生长速率甚至稍逊于葡萄糖碳源，可能是由于多聚果糖聚合度较高，菌株难以利用的原因。这一结论也与文献报道相一致，但多聚果糖由

于聚合度较高，在脂肪替代及缓解便秘等方面有其特殊应用。40 h后菌株进入生长稳定期，不同碳源下的OD600nm均趋于稳定。对比发酵40 h两歧双歧杆菌在不同碳源中的生长情况（图3），与葡萄糖碳源相比，保龄宝与青海威德公司的低聚果糖对两歧双歧杆菌的促生长作用分别为葡萄糖的2.71倍和1.96倍；青海威德与Orafti公司菊粉的促生长作用分别为葡萄糖的2.78倍和1.64倍; Orafti公司的多聚果糖未显示出对两歧双歧杆菌的促生长作用，其生长速率仅为葡萄糖的88%。

  肠道菌群中的双歧杆菌、乳酸菌等益生菌在利用果聚糖碳源发酵时会产生更多的短链脂肪酸，使环境的pH降得更低。这些短链脂肪酸不仅对营养肠上皮细胞，抵御病原微生物侵袭具有积极作用，同时可促进骨骼生长，调节血脂以及降低结肠癌的发病率。试验跟踪了两歧双歧杆菌在不同碳源发酵过程中体系pH的变化，从图4可见，随着发酵时间的增加，pH变化呈现出与生长曲线相一致的变化规律：在0～12 h的菌体生长适应期，体系pH基本保持不变；在12～40 h的对数生长期，pH变化明显，与葡萄糖碳源相比，低聚果糖和菊粉碳源均使体系的pH下降更多，约低0.3个pH单位。而多聚果糖碳源体系的pH在整个发酵过程中均变化不明显，可能与其聚合度较高有关；至40 h后的生长稳定期，不同碳源体系的pH均趋于稳定。

3结论

 考察了5种不同组成的商品果聚糖对两歧双歧杆菌体外生长的影响。结果表明，低聚果糖和菊粉均表现出了明显的促生长作用，而多聚果糖由于聚合度较高未呈现出对菌株的增殖效果。其中，保龄宝公司的低聚果糖与青海威德公司的菊粉对两歧双歧杆菌的促生长效果最好，与葡萄糖碳源相比，增殖能力分别达到2.71倍及2.78倍。由于果聚糖组成比较复杂，不同原料来源及不同生产工艺等均会带来差异，同时菌株对果聚糖的利用也是一个复杂的过程，不同菌株间也存在差异，还有很多问题值得深入研究。研究结果为不同组成的商品果聚糖的应用提供了参考。