刘鹏鹏，尚才人，黄建锋，周志南，吴渊，姜侃*
浙江省质量检测科学研究院（杭州310018）
摘要建立一种快速准确鉴定鸵鸟肉的方法。根据鸵鸟特异基因(NCBI序列号：AB254879)设计引物，运用PCR技术扩增鸵鸟特异基因，并验证方法的特异性和灵敏度。所设计的引物特异性良好，鸵鸟肉DNA扩增后产生112 b p的特异性条带，而其他肉类未见该特异性条带；该方法在核酸水平检出限为0.01 n g，样品水平检出限为0.1%。该方法快速准确、具有较高的特异性和灵敏度，可为鸵鸟肉鉴别真假提供技术支持。
关键词 聚合酶链反应；鸵鸟源成分；掺假；检测
随着时代进步，消费者对肉类营养及品质的要求变得更高。鸵鸟肉营养丰富，具有极高的营养价值，低脂肪、低胆固醇、低热量，可减少心血管疾病和癌症的发生。加之鸵鸟无疫情侵害，鸵鸟肉已成为国际公认的绿色健康食品。近年来国内人工饲养鸵鸟成为新兴的畜牧产业，但由于人工饲养鸵鸟规模仍比较小，鸵鸟肉价格比其他肉制品高出许多，受利益驱使不良商家以成本低廉的肉冒充鸵鸟肉，严重损害消费者利益，对市场秩序造成不良影响。因此建立一套快速、准确的鸵鸟肉鉴定方法成为当务之急。
目前，肉品种类鉴定主要方法大致可分为两类，一类是以蛋白质为基础，另一类则以核酸为基础。以蛋白质为基础的方法是利用免疫分析法检测特异性蛋白质，通过抗体及抗原的特异性结合来判读结果，常用的方法有酶联免疫分析法(Enzyme-linked immunesorbent assay，ELISA)、蛋白质免疫印迹(Western blot)、对流免疫电泳(Counter immune electrophoresis，CIE)及层析分析法（Chromatography）等，但此法受限于产品因受热、加压及化学处理后蛋白质变性，导致目标蛋白无法检出。而以核酸为基础的分析法主要是利用杂交法( Hybridisation)、限制性片段长度多态性聚合酶链反应( Polymerase chain reaction restrictionfragment length polymorphism．PCR-RFLP)、聚合酶链反应( Polymerase chain reaction，PCR)及实时定量聚合酶链反应( Real-time PCR)来达到定性及定量的目的，其中PCR因具有特异性、高灵敏性及快
速性的优点，较其他方法广泛应用于肉类品种鉴定分析。
试验以鸵鸟肉为研究对象，设计特异引物组，并用其他肉制品混合鸵鸟肉进行检测，建立鸵鸟肉鉴别方法，以期作为我国建立鸵鸟肉定性鉴定分析方法提供参考依据。
1 材料与方法
1.1材料与试剂
RNA提取试剂盒、反转录试剂盒：TAKARA；2×Taq PCR Master Mix: Tiangen;琼脂糖：法国Biowest。试验所需鸵鸟肉、鸡肉、鸭肉、猪肉和牛肉：市售。
1.2仪器与设备
Veriti梯度PCR仪：美国ABI公司；基础电泳仪：美国Bio-Rad公司；自动凝胶成像系统：美国Bio-Rad公司；DU730核酸蛋白分析仪：美国Backman公司。
1.3方法
1.3.1引物设计
根据鸵鸟特异基因（NCBI序列号：AB254879）
1.3.2 RNA提取与反转录
按照试剂盒说明书提取样品RNA，分光光度计测试OD260及OD280的，反转录得到的c DNA于-20℃冰箱保存备用。
1.3.3 PCR反应条件
1.3.4特异性试验
取鸵鸟肉、鸡肉、鸭肉、猪肉、牛肉和羊肉分别按1.3.2进行c DNA制备，并按照1.3.3进行PCR反应，反应结束后，电泳并照相保存。
1.3.5灵敏度试验
将提取后的鸵鸟c DNA经梯度稀释后浓度为100，10，1，0.1和0.01 n g，作为检测模板，按1.3.3建立的方法进行试验，在核酸水平上确定方法检出限。
1.3.6混合肉样检出限的测定
为了确定该检测方法在样品水平对混合量的检测极限值，将鸵鸟肉分别与牛、猪、鸡、鸭肉混合均匀，制成含鸵鸟肉成分分别为1%，0.1%和0.01%的混合样，每种混合样制备1 000 g，以1.3.2介绍的方法提取混合肉样DNA作为模板，以1.3.3建立的方法进行试验。
2结果与分析
2.1 PCR鉴定鸵鸟成分的特异性
结果如图1所示，鸵鸟肉样品可观察到产物大小为112 b p的特异性条带，牛、猪、鸡和鸭肉均没有该特异条带，说明试验所设计的引物不会与其他产生交叉反应。结果表明，试验所建立的PCR体系可正确扩增出预期产物且具有良好的特异性。
2.2 PCR鉴定鸵鸟成分的灵敏性
结果如图2所示，可观察到产物大小为112 b p的特异性条带，随着核酸浓度减少，其条带越来越暗且较细。当反应体系中DNA模板为0.01 n g时，经PCR扩增电泳后，仍可见明显特异性条带，方法检测限可达0.01n g。
2.3混合肉样检出限
结果显示，在牛、羊、鸡和鸭肉中含有1%、0.1%鸵鸟肉时，检测体系均能准确给出检测结果。但当鸵鸟肉含量为0.01%时，特异性条带不明显。说明鸵鸟源性检测体系对肉制品掺杂比例检测极限可达0.1%。
3结论与讨论
几年来，肉制品中动物源成分的掺假现象屡见不鲜，严重的损害了消费者的消费权益，影响着市场秩序。动物源成分的鉴定显得越来越重要，针对市场上常见的鸡、鸭、鹅、牛、羊、猪、马、驴和兔等成分鉴定，国家已制定了相应的检测标准。鸵鸟肉因其营养价值高消费市场越来越大，市场上以廉价肉冒充鸵鸟肉的现象层出不穷，而针对鸵鸟肉成分的鉴定仍鲜见文献报道，鸵鸟肉鉴定方法的落后严重影响了鸵鸟肉制品的监管。
PCR因具有特异性、高灵敏性及快速性的优点，较其他方法广泛应用于肉类品种鉴定分析。试验运用PCR技术原理，根据鸵鸟特异基因序列（NCBI序列号：AB254879）设计引物，扩增电泳后结果表明，所设计引物特异性良好，不与其他肉类产生交叉反应。本研究分别在核酸和样品水平对方法的检出限进行研究，结果表明该方法在核酸水平上检测灵敏度可达0.01 n g。混合肉样检测结果显示，鸵鸟源性检测体系对肉制品掺杂比例检测限可达0.1%。该方法检测限与同类方法检测限基本一致，能满足肉类掺假中肉种类的鉴定。
试验建立的鸵鸟源鉴定方法具有较高的特异性和灵敏性，操作简单、快速准确，可为食品监管部门鉴别真假鸵鸟肉提供技术支持。另外，该方法只是建立了鸵鸟肉鉴定的定性方法，如何定量检测鸵鸟肉成分的含量成为接下来研究方向和重点。
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