苯并[a]芘对刺参SOD和CAT酶活性影响研究

 魏海峰1，2，  刘长发1，2，  刘远1,2，  刘杨1,2

（1．大连海洋大学海洋科技与环境学院，辽宁大连116023；2．辽宁省高校近岸海洋环境科学与技术重点实验室，辽宁  大连  116023）

摘要：研究究实验室条件下刺参（Stichopus japonicus）暴露于不同浓度苯并[a]芘后，刺参体内超氧化物歧化酶(SOD)、过氧化氢酶(CAT)的变化规律。实验设置了 4个处理组(1.5.10.20 μg/L).空白对照组和丙酮溶剂对照组，在染毒2 h、6 h、12 h.24 h、2 d.4 d、7 d、14 d和21 d取样分析，其巾第14天放入清洁海水中恢复7d，分析了苯并[a]芘与刺参SOD.CAT之间的剂量、时间-效应关系。结果表明，在苯并[a]芘作用下，刺参的SOD酶活性在第6小时、12小时和21天时与苯并[a]芘浓度呈显著负相关,R6h=0.959 2(P<0.05).R12h=0.9458( P<005)、R21d=0.959 6( P<0.05)。刺参CAT的诱导随水体苯并[a]芘浓度的升高而增强，在第2天、第4天有显著的线性关系，其相关系数分别为R2d =0.790 6( 0.01P<0.05) .R4d =0.953 3( 0.01P<0.05)，由此表明，在苯并[a]芘染毒作用下，刺参组织解毒代谢指标SOD和CAT都出现了明显的时问一剂量效应，经相关性分析提出刺参组织SOD和CAT酶活力可以作为评价苯并[a]芘污染的生物标志物。

 关键词：苯并[a]芘；刺参；超氧化物歧化酶(SOD)；过氧化氢酶(CAT)

 中图分类号：X172doi：10.3969/j.issn．1003-6504.2016.04.007 文章编号：1003_6504(2016)04-0031-04

 人们对石油的需求量越来越多，海上运油、管道铺设也随之增多，溢油事件频发。例如渤海海域溢油事故、大连新港管道爆炸导致的溢油事故等给海洋生物带来了严重危害。溢油产生的有机污染物是一类毒性极大的环境污染物，具有难降解、高脂溶性、可以在食物链中富集放大等特点，能够通过各种传输途径进行长距离迁移。苯并[a]芘是溢油后重要的代谢产物，对海洋生物具有显著的毒性影响，研究有机污染物对海洋经济生物环境毒理学可以为环境质量评价和风险评估提供重要参考依据。超氧化物歧化酶(SOD)和过氧化氢酶(CAT)是生物体内重要的抗氧化酶，这些酶在生物体受到外界环境胁迫的情况下可以有效清除机体产生的自由基，从而保护有机体。超氧化物歧化酶(SOD)、过氧化氢酶(CAT)等酶活性早已证实可

作为环境监测和环境污染的早期生物预警信号，并为海洋有机污染环境生态风险评价提供参考数据。

 刺参（Stichopus japonicus）因其经济价值高、繁殖速度快、在我国北方地区广泛养殖，但是随着环境污染频发，环境污染物导致刺参大面积死亡时有发生，因此研究污染物特别是多环芳烃类污染物对刺参的毒性成为水产养殖行业的研究热点，使得刺参成为一种理想的生态毒理研究模式生物。本实验以刺参为实验动物，研究了不同浓度的苯并[a]芘对刺参SOD、

CAT酶活性的影响，以期从分子水平全面了解苯并[a]芘引起刺参的生理生化的生物响应，从而为海洋环境的生态风险评估提供科学的依据。

1材料和方法

1.1仪器与试剂

 仪器：751型紫外分光光度计（上海精科），5415R型台式离心机（Eppendorf公司）。

 试剂：苯并[a]芘化学试剂为色谱纯，纯度96%，购自Sigma公司。

1.2  实验动物和暴露实验设计

 刺参购自大连海宝渔业有限公司，离水体长(2.48+0.05) cm，健康有活力。实验海水为砂滤海水，并用水质分析仪进行水质检测，确定此曝气水适用于本实验，在120 cmx60 cm x 60 cm的玻璃缸循环系统内驯养7d，水温(15±1)℃，早晚定时投喂刺参饲料2次。苯并[a]芘用丙酮配成一定浓度的储备液，避光保存。实验容器为1L玻璃烧杯，设置4个质量浓度组(1、5、10、20 μg/L)及一个空白对照组和一个丙酮对照组。分别于暴露2h、6h、12 h、24 h、2d、4d、7d、14 d取样，于-80℃冰箱保存，在暴露14 d后，将不同浓度组的刺参均在砂滤海水中净化7d后，采样测定SOD、CAT酶活性。

1.3样品制备

 取冷冻的刺参组织样品((0.1±0.01)g)加5 m L预冷的生物匀浆液于组织匀浆机中匀浆2 min，然后立即进行冷冻离心，分别测定组织液的SOD、CAT酶活性。

1.4指标测定方法

 SOD活性采用黄嘌呤氧化酶法测定，CAT采用紫外吸收法测定。

1.5数据处理

 通过Excel数据处理软件，并制表分析。采用SPSS 17.0统计分析软件，在P=0.05的置信水平对SOD活性的变化情况进行单因素方差分析(One-Way ANOVA)，并用Sigmaplot 12.5软件绘图。

2结果

2.1  SOD酶活性结果

 苯并[a]芘对刺参SOD的诱导是个动态变化的过程，处理组与对照组相比，普遍出现了抑制现象，并且在第6小时、12小时和21天时出现了显著剂量一效应关系，见图1。浓度和时间是影响诱导活性的重要因素。在时间一效应关系方面，刺参SOD酶活性总体呈现出

抑制状态，除第2小时和2天苯并[a]芘处理组与对照组表现为无明显差异，第24小时20μg/L表现为极显著抑制，抑制率达到64.5%。从整个实验数据来看，各时间点处理组没有表现出明显诱导，此结果表明，刺参SOD酶在受到苯并[a]芘的刺激下，酶的活性被缓慢抑制，到24 h达到最大抑制率，而后有所恢复但依然表现为抑制效果。在第14～21天的恢复期，除了1yg/L处理组恢复到对照组水平外，5、10、20μg/L处理组的SOD酶的活性并没有完全恢复，依然表现为抑制效果，说明苯并芘浓度超过1μg/L，刺参染毒时间超过14 d后，SOD酶的自我修复能力受到破坏。

 剂量效应方面，刺参的SOD酶活性与苯并[a]芘浓度，在第6小时、12小时和21天时，呈显著负相关，(R6 h =0.959 2(P<0.05)、R12 h =0.945 8(P<0.05)、R21 d=0.959 6(P<0.05))，见图2。

2.2 CAT酶活性实验结果

 苯并[a]芘对刺参CAT酶活性显现出了显著的诱导效应，并且在CAT酶活性与苯并[a]芘第2天、4天的处理组出现了显著的剂量一效应关系，见图3。在时间一效应关系方面，CAT活性总体呈现出“钟形”变化趋势。其中在第2天各浓度梯度（1、5、10、20μg/L）总体呈现出最大活性，在第14天达到最低。此结果表明，刺参CAT酶在受到苯并[a]芘的刺激下，酶的活性立刻被诱导，达到较高活性，而后受到抑制逐渐降低，随着染毒时间的增加，酶的活性逐步恢复，在达到较高活性后，受到抑制逐渐降低。经过7d恢复，CAT酶的活性逐步达到对照组水平值。本实验采用了丙酮作为空白对照，其中在第4天20 μg/L浓度组出现最大的诱导率，其值为41.2%；在第14天15L.Lg/L浓度组和20 μg/L浓度组均出现最大抑制率，其值为5.2%。在第2小时，10 μg/L组与丙酮呈现出显著性差异，在第4天时，10、15和20 μg/L处理组组均与丙酮呈现出显著性差异。

  在剂量一效应关系方面，刺参CAT的诱导随水体苯并[a]芘浓度的升高而增强，但仅在第2天、第4天有显著的线性关系（图4），其相关系数分别为R2d=0.790 6(0.01<P<0.05)，R4d=0.953 3(0.01<P<0.05)。由此可见，高浓度苯并[a]芘诱导CAT的强度高于低浓度。

3讨论

 (1)以丙酮作为助溶剂与照组相比，刺参SOD和CAT都处于波动中，酶活性变化之间没有显著差异，说明丙酮作为助溶剂是可行的。苯并[a]芘对刺参的酶活性都存在抑制作用，污染物在实验的过程中酶活性都存在“钟形”的变化趋势，即酶活性在实验的某一点达到峰值。

 (2)在生物进化过程中，机体为了防御新陈代谢及其他生命活动中，氧自由基的损伤和破坏，相应发展了一套完善的抗氧化防御系统，包括谷胱甘肽(GSH)、维生素C、维生素E、谷胱甘肽(GPx)、超氧化物歧化酶(SOD)和过氧化氢酶(CAT)。SOD酶的作用是清除由于污染物胁迫机体产生的O2-和H2O2。从而SOD在胁迫初期SOD活性升高，在污染物胁迫下，抗氧化酶活性可能会出现抑制或者是诱导，诱导或抑制的出现一方面取决于生物体遭受胁迫的强度和时间，另一方面与遭受的生物种类的敏感性有关。本实验中刺参SOD和CAT酶活性与定污染物在某些时间段出现了显著的剂量-效应关系，整个实验过程中SOD和CAT酶活性都是呈现波动状态的，因此提示我们未来开展抗氧化酶活性的相关研究需要既要考虑浓度-剂量关系，也要考虑时间-剂量关系。

 (3)根据穆景利等和冯涛等报道，苯并芘[a]可分别诱导黑鲷EROD和大弹涂鱼组织SOD活性升高，并且与苯并芘暴露浓度呈现出显著的剂量-效应关系。王淑红等研究表明荧蒽、菲、芘等多环芳烃对菲律宾蛤仔消化腺SOD酶活性出现了先诱导，随后又抑制的实验现象。吴伟等还发现在溴氰菊酯暴露25 d内，罗非鱼肝脏GSH含量表现为先诱导升高，后降低趋势，与对照存在显著性差异。本研究表明，刺参SOD酶活性在苯并芘暴露情况下，未出现低浓度的诱导过程，而是在第6小时即出现了抑制现象，除第2天外，其它时间点的SOD均出现显著的抑制现象，而CAT酶活性与SOD酶活性显著不同，第2天和4天出现了诱导升高的现象，第14天出现了显著的抑制过程，经过净化恢复后，与对照组没有显著性差异。

 (4)本次实验，刺参14 d后解除暴露，净化7d后发现，各暴露水平中CAT酶活性均下降，与空白对照组没有显著性差异，说明设计的苯并芘暴露浓度对刺参造成的损伤没有超过自身恢复能力的范围，表明在低浓度条件下刺参的CAT酶具有一定的自我修复能力，该研究结果与穆景利等的研究结果相一致。而在同样浓度条件下SOD酶却没有恢复到空白对照组水平，说明SOD和CAT虽然都是抗氧化酶，但是其自我修复能力和敏感程度存在一定的差异性。在苯并[a]芘染毒作用下，刺参组织解毒代谢指标SOD和CAT都出现了明显的时间-剂量效应性，经相关性分析提出刺参组织SOD和CAT酶活力可以作为评价苯并[a]芘污染的生物标志物。

4结论

 本文研究了刺参暴露于不同浓度苯并[a]芘后，SOD和CAT酶活性在不同暴露时间动力学变化情况，结果表明，苯并[a]芘可以引起刺参机体SOD和CAT酶活性在暴露21 d内出现一定的波动变化，SOD酶活性在苯并[a]芘的胁迫下，出现了显著的抑制作用，CAT则出现了显著的诱导效应，经过一段时间的净化后，CAT酶活性都恢复到了正常状态，而SOD在高浓度组则出现了不可逆的损伤，因此净化实验可以帮助刺参恢复机体的正常状态，其毒性及恢复机理需要基因毒理学进一步研究阐述。SOD、CAT酶活性在苯并芘胁迫下，一定时间内出现了显著的剂量一效应关系，可以用于监测海洋环境的苯并[a]芘污染。