刺松藻抑藻活性物质分离的初步研究

 浦寅芳1，  苏振霞1，  肖辉2，  张志恒1，  王俊1，  孙颖颖1

 （1．淮海丁学院海洋学院，江苏连云港222005;2．江苏省海洋资源开发研究院，江苏连云港222000）

摘要：采用甲醇浸泡刺松藻干粉末，适当处理后，制备到此海藻的甲醇提取物（过滤和减压蒸干）。抑藻活性检测表明，当浓度为4.0 mg/m L时，此甲醇提取物明显抑制了米氏凯伦藻的生长。进一步采用2种液液萃取方法，对此提取物进行分离，共获得8个液液萃取分离组分。这些组分对米氏凯伦藻均表现出抑藻活性。在此基础上，采用化学成分系统预试验方法，初步分析了这些抑藻活性组分的化学成分。结果表明，刺松藻甲醇提取物的液液萃取分离组分中主要含有鞣质、有机酸和黄酮。最后，对抑藻活性组分进行了硅胶GF254薄层层析检测，得到了较为适宜的展开剂，为后续采用硅胶柱层析进行分离纯化奠定了良好的实验基础。目前，国内外尚未见刺松藻抑藻活性物质的相关研究。

 关键词：抑藻活性物质；刺松藻；分离；赤潮微藻

 中图分类号：X172 doi:10.3969/j.issn．1003-6504.2016.04.011 文章编号：1003-6504(2016)04-0053-05

 近年来，赤潮在全世界范围内频发，对近海水域生态环境和沿海水产业的可持续发展造成了极大的威胁。因此，用于赤潮预防、控制和减缓(PCM)的技术和方法引起了科学界和相应管理机构的重视。在这些技术和方法中，利用大型海藻进行赤潮预防、控制和减缓表现出显著的应用潜力。一系列研究成果表明，利用大型海藻对赤潮进行生物控制的方法显示出环境友好和低成本等优点，为赤潮防控提供了新的思路、研究方法和方向。

 目前，已经发现某些大型海藻对赤潮微藻生长的抑制作用。例如，龙须菜（Gracilaria lemaneiformis、羊栖菜（Sargassum fusiforme）、马尾藻（Sargassum spp.）、蜈蚣藻(Grateloupiafilicina)、石花菜(Gelidium anansii)，孔石莼( Ulva pertusa)和缘管浒苔(Enteromorpha linza)能抑制东海原甲藻（Prorocentrum donghaiense）、中肋骨条藻（Skeletonema  costatum）、塔玛亚历山大藻(Alexandrium tamarense)和赤潮异弯藻（Heterosigmaakashiwo）的生长。珊瑚藻（Lithophyllum spp.）和鼠尾藻（Surgassum thunbergii）抑制赤潮异弯藻和中肋骨条藻的生长。真江篱（Gracilaria verrucosa）和浒苔(Ulva prolifera)抑制米氏凯伦藻（Karenia mikimitoi）

的生长。然而，目前尚未见刺松藻（Codium fragile）抑制赤潮微藻的报道。

 刺松藻是一种世界性分布的绿藻，具有抗肿瘤、抗菌、抗病毒和抗凝血等作用。本文采用甲醇浸泡刺松藻干粉末，适当处理后，采用2种液液萃取方法，对甲醇提取物进行初步分离。抑藻活性检测后，采用化学成分系统预试验方法，分析抑藻活性组分的化学成分。最后，进行抑藻活性组分的硅胶GF254薄层层析检测，获得了较为适宜的展开剂，为后续采用硅胶柱层析分离纯化刺松藻的抑藻活性物质奠定了良好的实验基础。

1材料与方法

1.1  实验材料

 米氏凯伦藻（Karenia mikimitoi）由江苏省海洋生物技术重点建设实验室保存，f/2培养基中培养，培养温度为(20+0.1)℃，光照强度40μmol／(m2.s)，光暗比为12:12。

 刺松藻半干品来自于采购商，40℃下烘干4d后，粉碎(≤0.3 mm)。

 天然海水经过脱脂棉和300目筛绢过滤，煮沸、冷却，pH值和盐度分别调节至8.5和30备用（实验所用海水均做如上处理）。

 无水甲醇、乙酸乙酯和丙酮为分析纯。

1.2刺松藻抑藻活性物质的提取

 500 g刺松藻干粉末，置于5 000 m L锥形瓶中，加入3 000 m L甲醇，常温、黑暗浸泡。10 d后，滤纸过滤除去残渣，并用0.22μm有机系滤膜除去颗粒物干扰。40℃旋转蒸发除去甲醇，获得浸膏，即为刺松藻的甲醇提取物( MECF)。取适量提取物进行抑藻活性检测，其余提取物加入适量蒸馏水，充分振荡，4℃静置。12 h后，3 500 r/min下离心15 min，收集上清液，进行液液萃取分离。

1.2.1不同极性溶剂液液萃取分离

 上清液加入石油醚( 60～90℃)萃取3～4次，上层减压蒸干得石油醚相浸膏（组分A1），下层40℃减压蒸发除去甲醇后，加入适量蒸馏水后，用乙酸乙酯萃取3～4次，减压蒸干获得乙酸乙酯相浸膏（组分B1）。下层40℃减压蒸发除去甲醇后，加入正丁醇萃取3～4次，减压蒸干分别得到正丁醇相浸膏（组分C 1）和水相浸膏（组分Dl），4℃保存备用。

1.2.2不同pH下乙酸乙酯液液萃取分离

 上清液用1.0 mol/L Na OH调pH至11，乙酸乙酯萃取3次。乙酸乙酯相合并后，40℃减压蒸干，得浸膏（组分A2）。下层加入1.0 mol/L HC1调节pH至7，乙酸乙酯萃取3次后，乙酸乙酯相合并，减压蒸干得到浸膏（组分B2）。用1.0 mol/L HC1调下层溶液pH至2，乙酸乙酯萃取3次。上层和下层分别减压蒸干后，获得乙酸乙酯浸膏（组分C2）和水相浸膏(组分D2)，4℃保存。

1.3硅胶GF2s4薄层层析检测

 将刺松藻甲醇提取物的液液萃取分离组分，分别以石油醚：乙酸乙酯(2:1、3:2、1:1、2:3、1:2，V:V)和氯仿：甲醇(16:1、10:1、9:1、8:1、4:1.2:1、1:1，V:V)为展开剂，进行硅胶GF254薄层层析检测，紫外254 nm下观察。

1.4抑藻活性检测

1.4.1刺松藻甲醇提取物的抑藻活性实验

 分别加入一定体积MECF到f/2培养基中，混合均匀后，接种米氏凯伦藻，培养体系总体积为100 m L。米氏凯伦藻接种细胞数量为5xl04个／m L，MECF终浓度依次为0.5、1.0、2.0、4.0和8.0 mg/m L。同时，设定添加相同体积甲醇的对照组(甲醇加入体积不超过0.5 m L)，每个培养瓶设定3个平行样。所有培养瓶置于GX2-260B智能型光照培养箱中，温度(26±1)℃，

光照强度62μmol/(m2.s)，光暗比为12:12。每天定时摇动培养瓶2次，以防止微藻附壁生长。每隔1d从培养瓶中取1m L培养液，用Lugol's试剂固定后，计数藻细胞数量的变化。取样后向培养瓶中加入1 m L 100倍f/2培养液，以避免营养耗尽进而影响微藻的生长。

1.4.2液液萃取分离组分的抑藻活性实验

 将液液萃取分离组分加入到f/2培养基中，混合后，接种米氏凯伦藻，培养体系总体积为40 m L。米氏凯伦藻接种细胞数量为（14x104-16x104个／m L，分离组分终浓度均为1.25 mg/m L。同时，设定添加相同体积甲醇的对照组（甲醇加入体积不超过0.5 m L），每个培养瓶设定3个平行样，所有培养瓶置于GX2-260B智能型光照培养箱中，培养条件同上。

1.5化学成分系统预试验分析

 参照化合物常用化学鉴定方法，进行生物碱、酚酸、脂肪酸、萜类、内酯、鞣酸、有机酸和糖类等8种化合物鉴定试验。

  1.6数据处理

 实验数据采用SPSS 11.5软件包进行独立样本检 验统计分析，p<0.05为显著性差异，p<0.01为极显著  性差异。

 微藻生长抑制率，I=（1-N／N0）x100%，式中，N为处理组藻细胞数量（x104个/m L）；N0为对照组藻细胞数量（x104个/m L）。

  2结果与分析

  2.1刺松藻甲醇提取物的制备及其对米氏凯伦藻生长的影响

 以15.0 kg刺松藻干粉末为原料，经甲醇浸泡、过滤和减压蒸干等适当处理后，制备到240 g暗绿色甲醇提取物。将适量此提取物溶解于甲醇中，制备浓度为10 g/L母液，进行抑藻活性检测。

 图1表明，随浓度增加，甲醇提取物对米氏凯伦藻生长的抑制作用明显(p<0.05)增强。当浓度为4.0mg/m L时，甲醇提取物明显抑制了米氏凯伦藻的生长，其对米氏凯伦藻的生长抑制率为76.5%(10 d)。

2.2刺松藻甲醇提取物液液萃取分离及其对米氏凯伦藻生长的影响

 采用2种液液萃取方法，分别对甲醇提取物MECF (110 g)进行分离，共制备到A1、B1、C1和D1以及A2、B2、C2和D2等8个组分，质量依次为25.2、3.3、8.0和12.0 g以及29.4、2.7、3.9和8.1 g，得率见表1。将上述8个组分重新溶解于甲醇，配制浓度为2 g/L母液，进行抑藻活性检测，结果见图2。

 在图2(a)中，组分A1、B1和D1对米氏凯伦藻的生长表现出明显(p<0.05)的抑制作用。第10天，此3个组分对米氏凯伦藻的生长抑制率在80%以上。同时可以看出，组分C1也在一定程度上抑制了米氏凯伦藻的生长。在培养期间，此实验组藻细胞数量低于对照组。

 4个萃取组分中，组分A2、B2和C2显著(p<0.05)抑制了米氏凯伦藻的生长，第10天此3个组分对米氏凯伦藻的生长抑制率超过75%。同时可以看出，组分D2对米氏凯伦藻也表现出一定的抑藻作用，尽管在培养期间，此实验组藻细胞数量逐步增加，但仍然低于对照组(图2(b))，在整个培养期间，其细胞数量约为对照组细胞数量的65%。

 综上，对刺松藻甲醇提取物的所有液液萃取分离组分进行化学成分系统预试验分析。

2.3刺松藻甲醇提取物液液萃取分离组分的化学成分检测

 由表2可以看出，组分A1含有生物碱、鞣质和内酯／香豆素，可能含有黄酮，不含蒽醌和萜类／甾体；组分B1含有鞣质、黄酮和萜类／甾体，可能含有内酯／香豆素和有机酸，不含生物碱和蒽醌；组分C1含有生物碱、鞣质、有机酸、内酯／香豆素、黄酮和萜类／甾体，可能含有蒽醌，不含生物碱；组分D1含有酚类、有机酸、黄酮、鞣质和萜类／甾体，可能含有内酯／香豆素，不含生物碱和蒽醌。概括来讲，此4个分离组分中主要含有鞣质、有机酸、黄酮和内酯，香豆素，均不含蒽醌。

 表3表明，组分A2含有生物碱、鞣质、黄酮和萜类／甾体，可能含有内酯／香豆素和蒽醌，不含有机酸；组分B2含有生物碱、鞣质、有机酸、黄酮和萜类／甾体，可能含有内酯／香豆素和蒽醌；组分C2含有酚类、有机酸、黄酮和萜类／甾体，可能含有内酯／香豆素，不含生物碱和蒽醌；组分D2含有酚类和黄酮、可能含有内酯，香豆素，不含生物碱、有机酸、葸醌和萜类，甾体。分析得到，上述4个分离组分中主要含有黄酮、萜类／甾体、生物碱、酚类、鞣质和有机酸，可能含有内/厝豆素。

 综合分析，确定刺松藻中主要含有鞣质、有机酸和黄酮等化合物。同时发现，2种不同分离途径制备到的组分含有／可能含有或不含有的化学成分是不同的，我们认为这可能与提取条件（溶剂和pH）不同有关。 

2.4刺松藻甲醇提取物液液萃取分离组分的硅胶GF蹦薄层层析检测

 2种不同途径制备到的刺松藻液液萃取分离组分进行硅胶GF254薄层层析检测，结果见表4。每个液液萃取分离组分获得了较为理想的薄层层析展开，为后续采用硅胶柱层析进行这些组分的分离纯化奠定了良好的实验基础。

3讨论

 研究表明，大型海藻直接分泌或体内含有能抑制赤潮生物生长的化感物质，例如，多管藻属Polysiphonialanosa产生的聚酚、海头红(Plocamium hamatum)中的单萜、小珊瑚藻（Corallina pilulifera）中的溴仿、裂片石莼（Ulva fascisata）、红藻Neodilsea yendoana、黄藻CIadosiphon okamuranus、孔石莼和龙须菜(Gracilaria lemaneiformis )中的不饱和脂肪酸、缘管

浒苔的脂肪酸等。

 本文采用甲醇浸提，获得刺松藻提取物MECF。当浓度为4.0 mg/m L时，此提取物明显抑制了米氏凯伦藻的生长（图1）。Jeong等发现绿藻、褐藻和红藻门某些海藻的甲醇提取物能抑制多环旋沟藻（Cochlo- dinium polykrikoides）、长崎裸甲藻（Gymnodiniummikimotoi）和红色裸甲藻（Gymnodinium sanguineum）等赤潮微藻的生长。王仁君等也发现3种大型海藻缘管浒苔（Ulva linza）、小珊瑚藻（Corallina pilulifera）和鼠尾藻(Sargassum thunbergii)的甲醇提取物对东海原甲藻(Prorocentrum donghaiense)具有强烈的抑制作用。孙颖颖等研究表明，浒苔（Enteromorphaprolifera）甲醇提取物能明显抑制米氏凯伦藻（Kareniamikimitoi）、中肋骨条藻（Skeletonema costatum）和塔玛亚历山大藻(Alexandrium tamarense)的生长。

 进一步采用2种液液萃取分离方法，对甲醇粗提物进行了初步分离，共制备到8个萃取分离组分(表1)，这些组分均对米氏凯伦藻的生长表现出了抑制作用。其中，组分A1、B1和D1以及A2、B2和C2的抑藻作用更为强烈。在浓度1.25 mg/m L，它们对米氏凯伦藻的生长抑制率超过75%(10 d)（图2）。在此基础上，采用化学成分系统预试验方法，对8个分离组分的化学成分进行了初步分析。结果表明，刺松藻甲醇提取物的液液萃取分离组分中主要含有鞣质、有机酸和黄酮（表2和表3）。目前，尚不能确定哪些化学成分是8个分离组分抑藻活性的主要原因，需进一步分离纯化。化学成分系统预试验结果为后续工作明确了分

离目标和重点。

 更进一步采用硅胶GF254薄层层析对上述8个分离组分进行初步检测，获得较为理想的展开结果（表4），为后续采用硅胶柱层析进行抑藻活性物质的分离纯化奠定了良好的实验基础。