基于HS-SPME/GC-MS分析大肠杆菌污染鲜牛奶的挥发性成分

 周超，任佳丽*，周玉庭，黄江，马丽娜

 中南林业科技大学食品科学与工程学院（长沙410004）

摘  要  研究了基于顶空-固相微萃取／气质联用(Headspace-solid Phase Microextraction/Gas Chromatography-massSpectrometry，HS-SPME/GC-MS)分析大肠杆菌污染鲜牛奶的挥发性代谢产物的方法。选择75 μm碳分子筛／聚二甲基硅氧烷(Carbon/PolydimethyLsiloxane, CAR/PDMS)固相微萃取纤维头；Rtx-5色谱柱；升温程序：30C保持12min,4℃/min升到102℃，2.5℃/nun升到170℃, 10℃/min升到220℃。并基于以上方法检测到大肠杆菌污染鲜牛奶的19种主要挥发性成分（胺、酸、酮、醚、醛和烷烃类），空白鲜牛奶的17种主要挥发性成分（胺、酸、酮、醇、醛、烷烃），经综合分析得到大肠杆菌污染鲜奶的典型挥发性成分：2-羟基-丙酰胺、丙氨酰基-丙酰胺、3，6-二甲基-2, 5-哌嗪双酮、卡西酮、辛醛；该方法的建立可为基于挥发性代谢产物鉴别食源性致病菌污染提供理论依据和技术支持。

关键词顸空-固相微萃取／气质联用；大肠杆菌；鲜牛奶；挥发性成分

 牛乳营养丰富，含水量高，pH近中性，极易被致病微生物污染而引发食源性疾病，故快速检测和鉴定牛乳中的致病微生物污染对于保证牛乳品质和饮用安全至关重要。正常牛乳具有特殊的芳香味，而微生物污染导致的腐败则会使牛乳因蛋白质、脂肪等分解产生异味。所以，可以根据牛乳挥发性成分的变化鉴别致病微生物对牛乳的污染。大肠杆菌是牛奶在挤奶、运输和储藏过程中极易污染的一种致病菌，可引起腹痛、腹泻等食源性疾病，严重者甚至危及生命。因此，以大肠杆菌污染鲜奶为对象进行研究，对预防由此导致的食物中毒具有重要意义。

 气相色质谱联用仪( GC-MS)可对复杂的有机化合物进行高效的定性、定量分析，试验结合集萃取、浓缩、解吸、进样为一体的固相微萃取( SPME)样品前处理技术对大肠杆菌污染鲜奶的挥发性成分进行研究。由于每种微生物都有其特有的分解代谢途径，通过分析大肠杆菌的特征代谢产物组，可为开发基于挥发性代谢产物早期快速鉴别大肠杆菌污染牛乳的新技术提供理论基础。

1试验部分

1.1材料

 鲜牛奶：市售全脂巴氏杀菌乳(脂肪含量3.1%)，保质期内；菌种：大肠杆菌ATCC 25922；

胰酪胨大豆肉汤( Trypticase Soy Broth，TSB)：30 g于1000 m L蒸馏水；胰蛋白胨大豆琼脂(Tryptose SoyaAgar，TSA)：38 g于1 000 m L蒸馏水，煮沸溶解；乳糖胆盐发酵培养基：称取3.5 g煮沸溶解于100 m L蒸馏水；伊红美蓝琼脂( Eosin Methylene Blue Agar，EMB)：称取37.5 g煮沸溶解于1000 m L蒸馏水；营养琼脂：牛肉膏3g，蛋白胨10 g，NaCl 5 g，琼脂15 g，蒸馏水1000 m L，各药品于蒸馏水中煮沸溶解，调节pH至7.0～7.2，过滤分装并加塞包扎；以上培养基均121℃20 min高压灭菌备用。

1.2仪器与设备

 SPME手柄及75 μm CAR/PDMS（碳分子筛／聚二甲基硅氧烷）萃取头：美国，西格玛奥德里奇；气相色谱质谱联用仪：GC-MS Clarus 600，Perkins Elmer；SW-CJ-2F型双面净化工作台：苏州净化设备有限公司；数显电热培养箱：上海博讯实业有限公司医疗设备厂；ZNCL智能恒温磁力搅拌器：河南爱博特科技发展有限公司；电子分析天平；高压灭菌锅；万用电

炉；SK-1快速混匀器；冰箱：2℃~5℃。

1.3试验方法

1.3.1鲜牛奶污染情况确证

  用10 m L无菌移液管移取10 m L鲜牛奶，转移至100 m L无菌乳糖胆盐发酵培养基，振荡混匀；然后分装到有倒立发酵管的20 mm×150 mm试管中，每管10m L，3个平行管，以上操作在无菌条件下进行。

 把试管放置到恒温培养箱36℃±l℃培养24±2h；选择小倒管内有气泡的试管，三区划线于伊红美蓝琼脂平板，每管3个平板，于恒温培养箱36℃±1℃培养18～24 h后观察平板上的菌落特征。

1.3.2检样的制备

 接种：无菌移液管移取9 m L鲜牛奶加1 m L菌液做10倍递增梯度稀释，每递增稀释一次换一根1 m L无菌吸管。制备1.5×108 CFU/m L大肠杆菌菌液，经3次梯度稀释，得到含大肠杆菌1.5×105 CFU/m L的鲜牛奶（大肠杆菌污染鲜牛奶）。

 无菌移液管移取3 m L大肠杆菌污染鲜牛奶于顶空瓶中，换一根移液管移取3 m L不含菌的鲜牛奶于顶空瓶中作空白对照，每个顶空瓶中加一粒磁力搅拌子，拧紧带硅胶垫片的盖子。以上操作均在无菌条件下进行。

 培养：空白对照顶空瓶置于4℃冰箱，大肠杆菌污染鲜牛奶顶空瓶置于恒温箱36℃±1℃培养12 h后转移到4℃冰箱，抑制大肠杆菌继续生长，然后与空白一起进行GC-MS测定。

1.3.3  SPME的老化及萃取

 SPME萃取头的老化：试验用CARJPDMS萃取头，老化条件为300℃1～2 h，再把GC-MS进样口温度设置为300℃进行老化。

 萃取：先用智能恒温磁力搅拌器对顶空瓶进行恒温水浴加热和磁力搅拌（较大转速），顶空固相微萃取(Head Space Solid Phase Micro-extraction,HS-SPME)时条件相同，条件如表1所示。

1.3.4  SPME/GC-MS检测

 进样：把SPME缓慢插入GC-MS进样口进样，解吸10 min。

 GC-MS检测条件：色谱条件为进样口250℃，10：1的分流；氦气为载气，流速1.0 m L/min；色谱柱Rtx-5（0.25 mm ID×30 m×0.25μm d f），升温程序：30℃保持12 min，4℃/min升到102℃，2.5℃/min升到170℃，10℃/min升到220℃，保持8 min；整个升温程序70.2 min。质谱条件为电子轰击(EI)离子源，电离电压70 e V，离子源230℃，传输线230℃，扫描质量范围（m/z）33～650 amu。

2结果与讨论

 采用顶空固相微萃取气质联用( HS-SPME/GC-MS)检测得到的大肠杆菌污染鲜牛奶（大肠杆菌初始浓度1.5×105 CFU/m L，36℃±1℃培养12 h）和空白对照的GC-MS图谱如图1所示。

 图1和2分别是大肠杆菌污染鲜牛奶和空白各自的GC-MS谱图，由这两个图可以看出，大肠杆菌污染鲜牛奶谱图中的峰高度较空白谱图中的峰高度矮一些，且有一些新的峰出现，说明大肠杆菌污染鲜牛奶中有原物质消耗和新物质生成。

 各组分经Turbo MassTM NIST MS Search 2.0软件处理，根据质谱的匹配因子自动作出鉴定（NET>80的结果予以报道），结果参见表2。

 由表2可知，大肠杆菌污染鲜牛奶和空白对照鲜牛奶共有的挥发性物质有壬醛、辛酸、5，7-二甲基一十一烷、癸酸、十六烷、十九烷、3，8-二甲基一十一烷、2，6-二（1，1-二甲基乙基）-2, 5-环己二烯一1，4-酮、二十烷、二十七烷。丙氨酰基-丙氨酸、2-氰乙酰胺、3，6-二甲基-2，5-哌嗪双酮、2-羟基-丙酰胺、乙二酰胺、卡西酮、苯甲基，异戊基-乙醚、辛醛、2-十二酮是大肠杆菌污染鲜牛奶特有的挥发性物质；甲基丙烯酰胺、5-庚烯-2-酮、苯、苯乙酰胺、3-癸炔-2-醇、2-甲基一十一醛、萘是鲜牛奶特有的挥发性物质。

  鲜牛奶含有4.5%～5%的乳糖，大肠杆菌在鲜奶中以乳糖作为生长所需的唯一碳源，代谢为丙酮酸。鲜牛奶中蛋白质含量在3.7%左右，提供大肠杆菌生长所需的氮源。大肠杆菌能分泌胞外蛋白酶，把蛋白质分解成氨基酸。氨基酸在脱羧酶的催化下脱去羧基生成胺和二氧化碳。氨基酸发生脱氨基作用会生成酮酸和氨，由糖酵解作用生成的丙酮酸上羧基若与氨发生酸碱中和反应，羧羟基被氨基取代则生成酰胺键的结构；推测该大肠杆菌可能会产生羰基还原酶，将丙酮酸连有甲基的羰基还原成羟基。经过以上两种变化后丙酮酸就转化成了2-羟基-丙酰胺。大肠杆菌发酵时会代谢葡萄糖产生代谢副产物——乙酸。由此可知大肠杆菌污染鲜奶的pH会随大肠杆菌分解葡萄糖产生乙酸的累积而降低。2-羟基-丙酰胺的羟基在酸性条件下可能会发生质子化，然后与氨基发生脱水反应。所以，两分子2-羟基-丙酰胺可能会脱一分子水生成链状的丙氨酰基-丙酰胺，也可能会脱两分子水生成环状的3，6-二甲基-2，5-哌嗪双酮，结构式如图3所示。

 大肠杆菌分泌的胞外蛋白酶把鲜牛奶中的蛋白质分解成氨基酸，又知许多氨基酸是一碳单位来源，甲基就是一种-碳单位。所以，推测大肠杆菌污染鲜牛奶中检测到的卡西酮有可能是鲜牛奶中本来存在的苯乙酰胺，在大肠杆菌含有的甲基化酶的催化下利用氨基酸提供的一碳单位——甲基，使苯乙酰胺的碳氮单键断裂的同时发生甲基化形成，过程如图4所示。

 由表2知，鲜牛奶中检测到辛酸，大肠杆菌污染的鲜牛奶中检测到辛酸和辛醛。推测可能是辛酸的羧基与氨基酸脱氨基作用产生的氨发生酸碱中和，从而被酰胺化，之后又在大肠杆菌产生的还原酶的催化下被还原变成醛基，得到辛醛，如图5所示。

  根据大肠杆菌在鲜牛奶中的分解代谢和物质变化推测可知，2-羟基-丙酰胺、丙氨酰基-丙酰胺、3，6-二甲基-2，5-哌嗪双酮、卡西酮和辛醛是大肠杆菌污染鲜牛奶中典型挥发性成分。

3结论

 试验建立了HS-SPME/GC-MS检测大肠杆菌污染鲜牛奶挥发性成分的方法。结合Turbo MassTM NISTMS Search 2.0软件分析GC-MS总离子流图，检测到大肠杆菌污染鲜牛奶的19种挥发性成分（胺、酸、酮、醚、醛和烷烃类），空白对照鲜牛奶的17种挥发性成分（胺、酸、酮、醇、醛和烷烃类）。依据大肠杆菌在鲜奶中的分解代谢和物质转化，推测出2-羟基-丙酰胺、丙氨酰基-丙酰胺、3， 6-二甲基-2，5-哌嗪双酮、卡西酮、辛醛是大肠杆菌污染鲜奶的典型挥发性成分；可作为大肠杆菌污染鲜奶的典型标志物，也为基于挥发性代谢产物快速鉴别大肠杆菌污染鲜奶提供理论依据。