HPLC法测定不同选育猪肉中肌苷酸的含量

 王卫1，李翔1*，龚建军2，刘诗瑶1，郑自立1，尹超群1

 1．成都大学肉类加工四川省重点实验室（成都610106）；2．四川省畜牧科学研究院（成都610066）

摘要  以高效液相色谱法测定选育品种猪肉中肌苷酸的含量，以期建立一种评价选育品种猪肉风味前体物质的评定方法。采用DIONEX-HPLC仪，Alltech Apollo C18 (4.6 mm×250 mm，Ф5μm)色谱柱，甲醇-磷酸三乙醇胺(5：95)为流动相，柱温25 0C，检测波长254 nm,方法的检测限分别为0.004 μg/m L，方法精密度RSD值在4.65%~0.55%，平均回收率101.24%，线性范围0.4～20μg/m L。测定了培育的CH和S05品种猪肉中的肌苷酸的含量，CH猪样肌苷酸含量为1.642 g/kg，S05猪肉中肌苷酸含量为1.428 g/kg。优选品种CH猪肉中肌苷酸含量高于的对照品种猪S05的肌苷酸含量。通过对肌苷酸的含量对比分析，建立猪肉中鲜味物质的测定方法，为不同风味猪的选育建立评价体系。

关键词选育；猪肉；风味物质：肌苷酸；高效液相色谱

 肉及肉制品的营养、卫生和风味是我国肉类产业的三大研究方向，也是畜牧业生产肩负的历史重任。肉品风味包括滋味和香味，滋味来源于肉中的滋味呈味物质，主要是无机盐、游离氨基酸、小肽和核酸代谢产物如肌苷酸、核糖等非挥发性水溶性物质。肌苷酸( IMP)是畜禽肉中重要的鲜味物质，其增加鲜味的能力比谷氨酸钠( MSG)强几十倍，肌苷酸还是各

种调味食品的营养助鲜剂，其含量作为衡量新鲜度的指标，国际上已将其作为肉质鲜味的重要指标。测定肉类食品中IMP的含量对研究肉类食品风味及呈味物质之间的相互关系有着重要的意义。有报道采用紫外分光光度法检测不同品种猪肉中肌苷酸含量差异显著，另有研究显示保藏条件会影响虾肉中肌苷酸积累，而在冷藏条件下蒙山鸡肉中肌苷酸分解速度更慢，作为肉品质中重要指标的肌苷酸在各个选育品种的变化规律及与其它肉品质生化指标的相关性却未进行过系统性研究，采用HPLC法检测肌苷酸为不同选育品种猪肉风味建立稳定的评价指标的研究还不多见。

 以选育的S05和CH品种猪为研究对象，通过建立HPLC法测定选育猪肉中肌苷酸含量，评价选育品种猪肉风味物质质量指标的评定方法，旨在探索地方猪种优良肉质特性的形成和调控机制，为地方猪种资源的开发利用和优质猪肉的生产以及猪肉制品冷链物流中肉类品质控制提供参考依据。

1  材料与方法

1.1原料与仪器、试剂

 S05猪肉和CH猪肉由四川省畜牧科学研究院猪育种基地提供，S05系是该院培育的川藏黑猪配套系的一个专门化父系、由巴克夏猪直接选育而成。CH是配套系中的一个杂优组合、含巴克夏、藏猪与梅山猪血缘。饲养月龄6个月，体重90 kg，均取自背最长肌，-18℃储藏。

 戴安P680-DAD高效液相色谱仪；PDA光二级管阵列检测器；色谱柱Alltech Apollo C18( 4.6 mm×250mm，Ф5μm)。

 色谱级甲醇，其余试剂均为分析纯。肌苷酸对照品购于四川省食品与药品鉴定所。

1.2标准液配制

 准确称量20 mg肌苷酸标准物质至50 m L容量瓶，用50%甲醇溶液溶解并定容，为母液，于4℃冰箱中保存。吸取母液1.00 m L至10 m L容量瓶中，用50%甲醇溶液定容，配成质量浓度为40μg/m L的标准储备液，于4℃冰箱中保存。

1.3样品制备

 猪肉样品洗净切碎后用绞肉机绞碎至肉糜状。精确称取10.000 0 g，置于100 m L离心管，加入30 m L 5%预冷高氯酸，高速均质后，以4 000 r/min的转速离心5min，取上清液转入100 m L烧杯，残渣用30 m L 5%高氯酸振荡5 min，再以4 000 r/min离心5 min，合并上清液，用KOH溶液调pH至6.5，过滤至100 m L容量瓶，超纯水定容摇匀，做样品储备液。

1.4色谱条件

 色谱柱，Alltech Apollo C18( 4.6 mm×250 mm，Ф5μm)；流动相：A为甲醇溶液，B为磷酸三乙醇胺溶液（磷酸3.5 m L和三乙醇胺7 m L于100 m L容量瓶中，磷酸调pH至5.0，超纯水定容至刻度，摇匀），A：B=5：95，柱温25℃，流速0.8 m L/min，进样量10μL，检测波长248 nm。

1.5线性范围考察

 分别精密移取1.2中标准溶液分别吸取标准储备液各0.1，0.50，1.00，2.00和5.00 m L至10 m L容量瓶，用50%甲醇溶液分别稀释定容至10 m L，分别配成0.4，2.00，4.0，8和20μg/m L的溶液，在1.4色谱条件下分别进样3针。以标准品峰面积(Y)为纵坐标，以标准品溶液质量浓度（X，μg/m L）为横坐标，绘制标准曲线，进行回归分析，求其回归方程和相关系数R。

1.6精密度试验

 分别取质量浓度为0.4，4和20μg/m L的标准品溶液，在1.4色谱条件下分别连续进样5针，测定肌苷酸标准品的日间精密度。

1.7定量限和检测限试验

 将质量浓度为0.4μg/m L的标准品溶液依次稀释，分别进样3针，计算峰面积的平均值，以S/N的10倍和3倍确定其定量限和检测限。

1.8重现性试验

 精密称取S05猪肉肉糜6份，每份10.000 0 g，按1.3条件进行样品溶液制备，按照1.4色谱条件进行HPLC测定，计算含量，确定重现性。

1.9稳定性试验

 精密称取S05猪肉肉糜3份，按照1.3条件制备样品溶液，室温下放置1，2，4，8和12 h，按照1.4条件下色谱条件测定其峰面积，考察稳定性。

1.10回收率试验

 称取5.000 0 g S05猪肉肉糜3份，分别加入质量浓度为0.24 mg/m L肌苷酸标准溶液2.5 m L，按1.3制备样品，按1.4色谱条件进行HPLC分析。依据加标前后样品中肌苷酸浓度与加标量，计算肌苷酸的回收率。

1.11肌苷酸样品测定

 取10.000 0 g S05和CH猪肉肉糜各三份，按照1.3的方法制备，按1.4中的色谱条件进行分析，通过得出的色谱峰面积计算出猪肉中肌苷酸的含量，公式为：

2结果与分析

2.1色谱条件的选择2.1.1波长的选择

 将配制的标准溶液通过紫外分光光度计扫描，得到最佳波长为248 nm。

2.1.2色谱柱的选择

 用色谱柱AGILENT ZOBAX-NH2( 4.6 mm×250mm，Ф5μm)和Alltech Apollo C18进行试验，各色谱柱对分离效果影响不大，因此选用Alltech Apollo C18。

2.1.3流动相的选择

 考察甲醇-磷酸三乙醇胺体系，甲醇-甲酸铵体系，样品分离度和基线稳定性效果较好的为甲醇-磷酸三乙醇胺体系，当流速为0.8 m L/min时，考察甲醇一磷酸三乙醇胺体系的不同比例，当甲醇-磷酸三乙醇胺体系为5：95时，分离度大于1.5，保留时间在6 min左右，因此确定流动相为甲醇-磷酸三乙醇胺(5：95)。

2.1.4柱温的选择

 考察柱温在20℃，25℃和30℃下，肌苷酸分离效果25℃时最佳。综合优选确定色谱条件为：色谱柱Alltech Apollo C18（4.6 mm×250 mm，Ф5μm）；流动相：甲醇-磷酸三乙醇胺(5：95)；流速0.8 m L/mm，柱温25℃，检测波长248 nm；进样量10 VL。检测结果见图1。

2.2检测方法的建立

2.2.1标准曲线及线性范围

  在最佳色谱条件下建立的标准曲线方程为Y=0.380 4X-0.128 7,r=0.999 79，在0.4～20 μg/m L质量浓度范围内，肌苷酸有良好的线性关系。

2.2.2精密度试验

 在高中低三个浓度上测定了方法的精密度，试验结果表明该方法在高中低三个浓度范围内具有较好的精密度，RSD值在4.65%～0.55%，满足测定要求。结果如表1所示。

2.2.3方法检测限试验

  在最佳色谱条件下测定的肌苷酸标品溶液峰面积，当其质量浓度为0.02 μg/m L时，SN：约为10倍，当其浓度为0.004 μg/m L时，S/N约为3倍。因此，该分析方法检测限为0.004μg/m L。

2.2.4重现性试验

  6份S05猪肉肉糜样品的含量分别为1.415，1.425, 1.400, 1.455，1.435和1.420 g/kg。平均值为1.425 g/kg，RSD为1.31%（n=6）。表明该方法具有良好的重现性。

2.2.5稳定性试验

 3份S05猪肉肉糜样品在分别放置后测定的含量平均值结果见表2，试验表明，样品溶液在8h内其RSD为1.95%(，n=3)，稳定性良好。因此样品制备完毕后应该在8 h内完成测定。

2.2.6加样回收率试验

 以S05猪肉肉糜测为对象，在最佳色谱条件下测定的加样回收率结果见表3，平均回收率为101.24%，表明该方法具有较好的准确性。

2.3两种选育的猪肉样品中肌苷酸的含量测定  

在最佳色谱条件下对两种育种的猪肉进行测定，测定结果见表4。经计算品种CH猪肉中的肌苷酸含量为1.642 g/kg，品种S05猪肉中的肌苷酸含1.428 g/kg。

3结论

 探讨为现代选育品种猪肉风味评价指标肌苷酸含量测定，建立精确度和准确性更高的液相色谱法。在总结前人研究的基础上，通过对HPLC法各项分析条件的改进，采用戴安P680-DAD高效液相色谱仪，PDA光二级管阵列检测器，色谱柱Alltech Apollo C18（4.6 mm×250 mm，Ф5μm），甲醇-磷酸三乙醇胺(5：95)为流动相，能很好地将肌苷酸分离出来，

且峰型较好，两个猪肉样品的出峰时间分别是5.53和5.55 min，样品中肌苷酸与标准品保留时间基本一致，在0.4～20 μg/m L质量浓度范围内，肌苷酸有良好的线性关系，平均加标回收率为101.24%，有良好的重现性和稳定性。该法在高中低三个浓度范围内具有较好的精密度，RSD值在4.65%～0.55%。以方法检测出选育品种猪肉样品中，CH猪样肌苷酸含量为1.642g/kg，S05猪肉中肌苷酸含量为1.428 g/kg。由此可见培育的猪种CH肌苷酸含量高于S05猪种，这与我国地方品种猪肉品质优良、风味浓郁肌肉细嫩多汁相一致，猪肉中肌苷酸含量存在品种差异，这表明肌苷酸含量受遗传因素影响也就是说可以通过系统选育提高肌苷酸含量培育优质配套系，为探索地方猪种资源的开发利用和优质猪肉的生产及肉类品质控制提供科学依据。