响应面法优化水提黑皮鸡枞菌多糖工艺

 吴素蕊，严明，张鑫，游金坤，高观世*

 中华全国供销合作总社昆明食用菌研究所（昆明650221）

摘要通过单因素试验选取试验因素与水平，再根据-Box-Behnken的中心组合试验设计及响应面法分析建立二次回归模型，对提取温度、提取时间和料液比进行优化组合，研究了野生黑皮鸡枞菌多糖的提取工艺。结果表明，黑皮鸡枞菌多糖提取的最佳工艺条件为：提取温度82℃、提取时间3.9 h、水料比26：1(m L/g)。在此工艺条件下，野生黑皮鸡枞菌多糖得率为26.72%。

关键词  黑皮鸡枞菌；响应面法；多糖：提取工艺

 鸡枞菌(Termitomyces robustus( Belli) Heim)，又名蚁枞，属担子菌纲，伞菌目，口蘑科，蚁巢伞属，是一种珍贵的野生食用菌，主要分布在我国的云南、贵州和台湾等地。它富含人体所需的氨基酸及蛋白质，铁、磷和钙等矿物质，维生素等物质；谭晓虹等研究了云南鸡枞菌中多糖的提取，得出其多糖的平均含量为26.07%。食用菌多糖往往具有增强免疫、抗肿瘤、抗氧化、抗病毒、降低血糖、抗溃疡、抗衰老和抗辐射等方面的生物活性；尤其表现在提高机体免疫力及抑瘤活性方面的重要作用。

 根据世界鸡枞菌检索表可知，黑皮鸡枞菌学名烟灰鸡枞菌(T．fuliginous in Les Agaricus Temitophiles，147( 1957))属鸡枞菌属。试验研究云南产黑皮鸡枞（Termitomyces eurrhizus）多糖的提取工艺。以野生黑皮鸡枞菌为原料，采用热水浸提法提取多糖，在单因素试验的基础上，采用Box-Behnken中心组合试验设计及响应面分析法对黑皮鸡枞菌多糖的提取工艺进行优化，为这一野生资源的综合开发利用提供技术依据。

1材料与方法

1.1试验材料

 野生黑皮鸡枞菌，购自云南省峨山彝族自治县，-4℃冰箱冻藏备用。

 硫酸、苯酚、葡萄糖、无水乙醇、丙酮，均为分析纯。

 AL204电子天平：梅特勒-托利多仪器（上海）有限公司；Q-25083高速多功能粉碎机：上海冰都电器有限公司；SHZ-D(Ⅲ)循环多用真空泵：巩义市子华仪器有限责任公司；HH-4数显恒温水浴锅：金坛市科析仪器有限公司；TU1901双束紫外可见分光光度计：北京普析通用仪器有限责任公司；OSB-2100旋转蒸发仪：上海爱朗仪器有限公司；BCD-218e伊莱克斯冰箱：伊莱克斯股份有限公司；LXJ-ⅡB大容量离心机：上海安亭科学仪器厂。

1.2试验方法

1.2.1  黑皮鸡枞菌多糖的提取

1.2.1.1黑皮鸡枞菌预处理

 将新鲜黑皮鸡枞菌进行筛选、除杂、清洗、切片、烘干后，粉碎过70目筛。

1.2.1.2热水浸提法提取黑皮鸡枞菌多糖

 称取过筛后的黑皮鸡枞菌粉末1.0 g，在设定不同水浴温度、水浴时间和水料比条件下提取黑皮鸡枞菌多糖。热水浸提完成后迅速冷却至室温，真空抽滤，将滤液浓缩至原体积的1/4，加4倍体积乙醇（体积分数为95%）静置24 h。于6 000 r/min离心10 min，取底层沉淀物，80%乙醇洗3遍，丙酮洗2遍，真空干燥后得粗多糖样品。平行试验3次。

1.2.2黑皮鸡枞菌多糖含量的测定

 采用苯酚-硫酸法测定。1.2.3多糖得率的计算采用重量法测定。

  多糖得率=样品多糖质量(g)／样品质量(g)×100% (1)

2结果与分析

2.1单因素试验

2.1.1提取温度对多糖提取率的影响

 确定水浴时间2h、水料比20：1（m L/g），研究不同提取温度对多糖得率的影响。设计提取温度分别为50℃，60℃，70℃，80℃和90℃，试验结果如图1所示。

 由图1可以看出，在50℃～80℃时，多糖提取率随温度升高不断增加；当温度超过80℃，多糖提取率随着温度上升略有下降。其原因可能与多糖本身的结构及活性有关，过高的温度导致多糖分子结构降解，从而导致提取率的下降。由此可见，浸提温度不宜太高，80℃为最适提取温度。

2.1.2提取时间对多糖提取率的影响

  确定提取温度80℃、水料比20：1(m L/g)，研究不同提取时间对多糖得率的影响。设计提取时间分别为1.5，2，2.5，3，3.5和4h，试验结果如图2所示。

 由图2可知，在1.5～3.5 h期间，随水浴时间的不断延长，多糖提取率呈上升趋势；在3.5 h以后，提取率开始呈现略微下降的趋势。这说明多糖提取率受时间因素的影响，在较短时间水浴下，黑皮鸡枞菌中的多糖无法充分溶出，影响提取效率；水浴时间过长，可能会造成部分已溶出的多糖发生结构变化，提取率降低。由此可见，浸提时间不宜过长，3.5 h为最佳浸提时间。

2.1.3水料比对多糖提取率的影响

 确定提取温度80℃、提取时间3.5 h，研究不同水料比对多糖得率的影响。设计水料比分别为10：1，20：1．30：1.40：1和50：1（m L/g），试验结果如图3所示。

 由图3可知，随着水料比的提高，多糖提取率呈增加趋势。水料比为10：1～30：1(m L/g)时，多糖提取率几乎呈直线上升趋势；水料比为30：1(m L/g)之后，提取率增加缓慢，趋势趋于平缓。这说明在水料比为30：1（m L/g）时，有效成分提取已经较为完全，这是因为溶剂用量与多糖溶出存在对应的平衡关系。因此，确定30：1（m L/g）为最佳水料比。

2.2响应面试验

2.2.1  响应面试验结果及方差分析

 在单因素试验的基础上，依照Box-Behnken的中心组合试验设计原理，进行3因素3水平试验优化多糖提取工艺。响应面试验因素与水平见表1。

如表2所示，析因试验的试验号为1～12，零点试验的试验号为13～15，其中自变量取值在A、B和C构成的三维顶点为析因点；区域中心点为零点，重复零点试验3次，估计试验误差。试验设计及结果见表2。

 拟合得到多糖得率的预测值对各因素的回归方程为：

对回归模型进行方差分析，结果见表3。

 由表3可知，模型的p=0.001 1，表明黑皮鸡枞菌多糖提取率的回归模型结果非常显著。失拟项F=0.074 4，说明模型计算结果与检验结果的差异不显著。该模型的负相关系数平方R2=0.978 9，说明试验方法可靠；修正相关系数平方R2Adj=0.940 9，变异系数CV%=1.43，表明多糖提取率模型拟合性好，可以较好地预测鸡枞菌多糖的工艺试验结果。由表3还可知，A、B和C的p值均小于0.01，说明这3个试验因子对多糖提取率影响极为显著；AB、BC、B2和C2的p值均小于0.05，表明对多糖提取率影响非常显著。由p值大小可以推断因素对多糖提取率影响大小排序为：提取时间(A)>提取温度(B)>水料比(C)。根据回归方程和方差分析，得到各因子交互作用三维响应面曲面图和等高线图，如图4~图6所示。

 由图4~图6可以看出，影响因素提取温度、提取时间和水料比对鸡枞菌提取影响都非常显著，其中提取时间与水料比的交互作用最为显著，提取温度与提取时间次之，此结果与回归分析结果吻合。由图4可知，在提取时间相同的情况下，提取率随着提取温度的升高先增加后减小；在提取温度相同的情况下，提取率随时间的延长而逐渐增加，这与单因素试验结果一致。由图5可知，水料比的曲线比提取温度的曲线较陡，表明水料比对试验结果的影响大于提取温度的显著性。由图6当提取时间一定，随着水料比的增加，多糖得率也随之增加，说明水料比对多糖提取率呈正相关性。比较三组图可知，提取时间对黑皮鸡枞菌多糖提取率的影响最为显著，表现为曲线较陡，提取温度的影响较为显著，而水料比的影响不显著，表现为曲线较为平滑。

2.2.2响应面分析检验

 根据上述优化条件得到最佳提取工艺条件：提取温度81.85℃、提取时间3.93 h、水料比26.27：1(m L/g)，通过回归方程得出预测值为26.779 6%。考虑实际操作可行性，将多糖的提取条件修正为：提取温度82℃、提取时间3.9 h、水料比26：1(m L/g)。进行3次平行验证试验，多糖的平均得率为26.72%，与预测值相差0.059 6%,这说明该方程与实际情况拟合较好。采用响应面优化的提取条件准确可靠，能够为鸡枞菌多糖的提取提供指导。

3结论

  在单因素试验的基础上，通过响应面法优化水提黑皮鸡枞菌多糖的工艺，最佳提取工艺为：提取温度82 0C、提取时间3.9 h、水料比26：1(m L/g)，在此条件下黑皮鸡枞菌多糖得率为26.72%。