间歇式微波处理提取银杏愈伤组织黄酮的研究

 邓祥宜1，林立春1，李艳玲1，熊苏舒1，罗云桃1，周竹青2*

1．武汉设计工程学院食品与生物科技学院（武汉430205）；2．华中农业大学生命科学技术学院（武汉430070）

摘要  以银杏愈伤组织为原料，通过单因素试验和响应面试验优化了间歇式微波处理提取黄酮的工艺条件。试验结果表明，响应面试验的最佳提取条件是乙醇体积分数48.09%，液料比值35 m L/g，微波时间84.44 s；验证性试验中此条件下的黄酮得率为17.207 mg/g，与预测值17.114 mg/g非常接近。

关键词银杏愈伤组织；黄酮；提取条件优化；响应面分析

  银杏的主要活性成分是黄酮类化合物，其以黄酮糖苷和黄酮苷元的形式存在，在乙醇水溶液中溶解较好。银杏黄酮具有抗氧化、降血脂、抗炎症、抗肿瘤、抑菌和抗病毒等功能，在临床治疗和保健方面拥有独特的价值。银杏愈伤组织黄酮含量高于叶片，具有一定的应用前景。目前，关于银杏叶片黄酮提取方法的研究较多，而对银杏愈伤组织中黄酮提取条件的研究较少。

  微波辅助提取是快速而有效的提取方法，但微波处理过度会造成以槲皮素为苷元的糖苷的降解，这可能与微波引起的热效应有关，采用间歇式的微波处理，是避免升温过高导致黄酮破坏的有效方法。前期试验结果表明，微波辅助水浴浸提法能较好地提取银杏愈伤组织黄酮，单次得率达到77.95%，但水浴浸提过程仅使得黄酮得率在微波处理的基础上提高了5.5%，从简化提取工序、降低能耗等方面考虑，可删除水浴处理过程，直接运用微波处理来提取银杏愈伤组织黄酮。试验通过单因素试验和响应面试验对间歇式微波处理提取银杏愈伤组织黄酮的工艺条件进行研究，以期为组织培养生产银杏黄酮作铺垫。

1  材料与方法

1.1  材料及主要仪器设备

 银杏愈伤组织：武汉设计工程学院食品与生物科技学院实验教学中心；芦丁标准品：国药集团化学试剂有限公司；其它试剂均为分析纯。

 WFZ UV-2000型紫外可见分光光度计：尤尼柯（上海）仪器有限公司；DH6-914385-Ⅲ电热恒温鼓风干燥箱：上海新苗医疗器械制造有限公司；P80D-23NIP-B5( BO)微波炉：佛山市顺德区格兰仕微波炉电器有限公司。

1.2试验方法

1.2.1愈伤组织的培养及收获

 愈伤组织培养、收获方法。

1.2.2黄酮提取工艺流程及测定方法

 银杏愈伤组织粉末0.2 g→加入乙醇水溶液→摇匀后微波处理（间歇式微波处理：每处理5s，水浴冷却一次；功率为中火528 W）~4 000 r/min离心15 min→取上清液测定黄酮含量，计算得率

 黄酮含量测定方法采用Al(NO3)3显色法，芦丁标准曲线回归方程y=1.313 5x-0.024 3，其

中，y-OD540，x-芦丁含量(mg)，R2=0.999 5。

1.2.3微波处理方式的比较

  称取2份0.200 g银杏愈伤组织粉末，分别加入5m L 40%的乙醇溶液，微波处理60 s，一组以间歇式的微波处理方法，每处理5s水浴冷却一次，一共处理60s；另一组以连续式微波处理的方式，一次性加热60 s。黄酮提取和含量测定其他操作参照1.2.2进行。每个梯度做2个平行，结果以“平均值±标准差”表示。

1.2.4单因素试验方法

  乙醇体积分数的优化：称取9份0.200 g银杏愈伤组织粉末于10 m L离心管中，分别加入5 m L的0，30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90%和100%的乙醇溶液，微波处理60 s，黄酮提取和含量测定其他操作参照1.2.2进行。每个梯度做2个平行，结果以“平均值±标准差”表示。

  液料比值的优化：保持提取剂（40%乙醇溶液）体积不变，改变愈伤粉末重量，研究液料比值为10，20，25，30，40，50和100 m L/g对黄酮得率的影响。微波处理60 s，黄酮提取和含量测定其他操作参照1.2.2进行。每个梯度做2个平行，结果以“平均值±标准差”表示。

  微波处理时间的优化：称取8份0.200 g银杏愈伤组织粉末，分别加入5 m L的40%的乙醇溶液，微波处理时间梯度为0，10，30，60，90，120，180和240s。参照1.2.2进行黄酮提取和含量的测定。每个梯度做2个平行，结果以“平均值±标准差”表示。

1.2.5响应面试验设计

  根据单因素试验结果，运用Design-Expert 8.0.6.0软件设计中心组合试验，建立黄酮提取模型，预测最佳提取条件和黄酮得率。试验因子编码及水平设计见表1。

1.2.6验证性试验

  在响应面分析的最优工艺条件下进行5次重复提取，验证模型的可靠性。

2结果与分析

2.1微波处理方式对黄酮得率的影响

 不同微波处理方式对黄酮得率影响的试验结果（图1）显示：间歇式处理的黄酮得率为16.43 mg/g，高于连续式处理的得率14.24 mg/g。试验中观察到，连续式处理导致了提取剂的暴沸，使得一些原料粉末溅到容器壁上，不利于提取；同时，该过程温度较高，可能导致黄酮被破坏，所以试验采用间歇式微波处理的方式。

2.2  乙醇体积分数对黄酮得率的影响

  试验结果（图2）显示：当用乙醇体积分数为0时，黄酮的得率为6.03 mg/g;随着乙醇体积分数提高，黄酮得率呈现出递增的趋势，乙醇体积分数为50%时，黄酮的得率达到最大，为15.84 mg/g;之后随着乙醇体积分数进一步升高，黄酮的得率呈现下降的趋势，用无水乙醇提取时，黄酮的得率仅为7.23 mg/g。因此，选择乙醇体积分数50%为最佳体积分数。

2.3液料比值对黄酮得率的影响

  液料比值对黄酮得率影响的试验结果（图3）表明：当液料比值为10 m L/g时，黄酮得率为9.14 mg/g;随着液料比值逐渐增大，黄酮的得率大幅增加，当液料比值为30 m L/g时，黄酮的得率为16.43 mg/g；接着，黄酮得率虽然随着液料比值的增大继续增大，但是上升趋势减小。基于节约成本等考虑，选择30 m/g为最佳液料比值。

2.4微波处理时间对黄酮得率的影响

  不同微波处理时间对黄酮得率影响的试验结果（图4）表明：当微波处理时间为Os时，黄酮得率为7.98 mg/g；随着微波时间的增加，黄酮得率逐渐增加，微波时间为60 s时，黄酮得率达到15.62 mg/g;超过60 s后，黄酮得率趋于稳定并在180 s后表现出轻微的下降趋势。这可能是因为微波处理有利于黄酮的溶出，但处理时间过长可能造成少量黄酮被破坏。故选取60 s为最佳微波时间。

2.5  响应面试验结果及分析

 中心组合试验结果见表2，利用Design-Expert 8.0.6.0软件进行二次响应面回归分析，得到黄酮提取模型的

方差分析结果见表3。回归模型p<0.000 1<0.01，说明模型极显著；失拟项p=0.077 3>0.05，不显著，说明模型拟合度良好，无失拟因素存在；R2Adj=0.947 2>0.80，说明该模型94.72%的变化都与试验因素有关，变异系数(c．v．)为2.03%，说明该模型只有2.03%的变异，进一步说明该模型拟合度高，所以可以用该模型模拟各因素对黄酮得率的影响。

 交互项AB、AC和BC的P均大于0.05，说明乙醇体积分数与液料比值、乙醇体积分数与微波时间、液料比值和微波时间的交互作用项不显著。模型二次项系数全为负，结合响应面图（图5）看出，回归方程存在顶点，说明响应值有最大值。通过软件D e sign-Expert  8.0.6.0预测出最优提取工艺：乙醇体积分-数48.09%，液料比值35 m L/g，微波时间84.44 s，此条件下的预测值为17.144 mg/g。

2.6验证性试验结果及分析

 验证性试验结果（表4）表明：在响应面最优条件下，总黄酮得率为17.207 mg/g，与预测值17.144 mg/g接近。

3结论与讨论

 通过单因素试验和响应面试验得到了银杏愈伤组织黄酮提取的最优条件：以48.09%乙醇为提取剂，液料比值为35 m L/g，在中火档(528 W)微波处理84.44s。该条件下的黄酮得率17.207 mg/g，与预测值17.114mg/g-致。

  试验最优条件下的黄酮得率较之前研究( 20.92mg/g)偏低，这是因为试验与之前的研究使用了同一批材料，该材料储存了约9个月，黄酮含量有所下降（数据未展示）。可见，在愈伤组织收获之后，应尽快进行黄酮的提取和含量测定。